ABSTRACT We have developed a generally applicable method based on CRISPR/Cas9-targeted ultra-long read sequencing (CTLR-Seq) to completely and haplotype-specifically resolve, at base-pair resolution, large, complex, and highly repetitive genomic regions that had been previously impenetrable to next-generation sequencing analysis such as large segmental duplication (SegDup) regions and their associated genome rearrangements that stretch hundreds of kilobases. Our method combines in vitro Cas9-mediated cutting of the genome and pulse-field gel electrophoresis to haplotype-specifically isolate intact large (200-550 kb) target regions that encompass previously unresolvable genomic sequences. These target fragments are then sequenced (amplification-free) to produce ultra-long reads at up to 40x on-target coverage using Oxford nanopore technology, allowing for the complete assembly of the complex genomic regions of interest at single base-pair resolution. We applied CTLR-Seq to resolve the exact sequence of SegDup rearrangements that constitute the boundary regions of the 22q11.2 deletion CNV and of the 16p11.2 deletion and duplication CNVs. These CNVs are among the strongest known risk factors for schizophrenia and autism. We then perform de novo assembly to resolve, for the first time, at single base-pair resolution, the sequence rearrangements of the 22q11.2 and 16p11.2 CNVs, mapping out exactly the genes and non-coding regions that are affected by the CNV for different carriers.

Abstract Segmental duplications or low copy repeats (LCRs) constitute complex regions interspersed in the human genome. They have contributed significantly to human evolution by stimulating neo- or sub-functionalization of duplicated transcripts. The 22q11.2 region carries eight LCRs (LCR22s). One of these LCR22s was recently reported to be hypervariable in the human population. It remains unknown whether this variability exists also in non-human primates. To assess the inter- and intra-species variability, we de novo assembled the region in non-human primates by a combination of optical mapping techniques. Orangutan carries three LCR22-mediated inversions of which one is the ancient haplotype since it is also present in macaque. Using fiber-FISH, lineage-specific differences in LCR22 composition were mapped. The smallest and likely ancient haplotype is present in the chimpanzee, bonobo and rhesus macaque. The absence of intra-species variation in chimpanzee indicates the LCR22-A expansion to be unique to the human population. Further, we demonstrate that LCR22-specific genes are expressed in both human and non-human primate neuronal cell lines and show expression of several primate LCR22 transcripts for the first time. The human-specificity of the expansions suggest an important role for the region in human evolution and adaptation. Author summary Low copy repeats or segmental duplications are DNA segments composed of various subunits which are duplicated across the genome. Due to the high level of sequence identity between these segments, homologous regions can misalign, resulting in reciprocal deletions and duplications, classified as genomic disorders. These regions are subject to structural variation in the human population. We recently detected extreme structural variation in one of the most complex segmental duplication regions of the human genome, the low copy repeats on chromosome 22 (LCR22s). Rearrangements between the LCR22s result in the 22q11.2 deletion/duplication syndrome, the most common human genomic disorder. However, it remains unknown whether this variability is human-specific. In this study, we investigated those LCR22s in several individuals of the different great apes and macaque. We show only the smallest haplotype is present without any intra-species variation in the Pan genus, our closest ancestors. Hence, LCR22 expansions are human-specific, suggesting a role of these LCR22s in human evolution and adaptation and hypothesize the region contributes to the 22q11.2 deletion syndrome inter-patient phenotypic variability.

Abstract The 22q11.2 deletion syndrome (22q11.2DS) is the most common microdeletion disorder. Why the incidence of 22q11.2DS is much greater than that of other genomic disorders remains unknown. Short read sequencing cannot resolve the complex segmental duplicon structure to provide direct confirmation of the hypothesis that the rearrangements are caused by non-allelic homologous recombination between the low copy repeats on chromosome 22 (LCR22s). To enable haplotype-specific assembly and rearrangement mapping in LCR22 regions, we combined fiber-FISH optical mapping with whole genome (ultra-)long read sequencing or rearrangement-specific long-range PCR on 24 duos (22q11.2DS patient and parent-of-origin) comprising several different LCR22-mediated rearrangements. Unexpectedly, we demonstrate that not only different paralogous segmental duplicon but also palindromic AT-rich repeats (PATRR) are driving 22q11.2 rearrangements. In addition, we show the existence of two different inversion polymorphisms preceding rearrangement, and somatic mosaicism. The existence of different recombination sites and mechanisms in paralogues and PATRRs which are copy number expanding in the human population are a likely explanation for the high 22q11.2DS incidence.

Low copy repeats (LCRs) are recognized as a significant source of genomic instability, driving genome variability and evolution. The chromosome 22 LCRs (LCR22s) are amongst the most complex regions in the genome and their structure remains unresolved. These LCR22s mediate non-allelic homologous recombination (NAHR) leading to the 22q11 deletion syndrome (22q11DS), causing the most frequent genomic disorder. Using fiber FISH optical mapping, we have de novo assembled the LCR22s in 33 cell lines. We observed a high level of variation in LCR22 structures, including 26 different haplotypes of LCR22A with alleles ranging from 250 Kb to over 2,000 Kb. An additional four haplotypes were detected using Bionano mapping. Further, Bionano maps generated from 154 individuals from different populations suggested significantly different LCR22 haplotype frequencies between populations. Furthermore, haplotype analysis in nine 22q11DS patients resulted in the localization of the NAHR site to a 160 Kb paralog between LCR22A and -D in seven patients and to a 31 Kb region in two individuals with a rearrangement between LCR22A and -B. This 31 Kb region contains a palindromic AT-rich repeat known to be a driver of chromosomal rearrangements. Our study highlights an unprecedented level of polymorphism in the structure of LCR22s, which are likely still evolving. We present the most comprehensive map of LCR22 variation to date, paving the way towards investigating the role of LCR variation as a driver of 22q11 rearrangements and the phenotypic variability in 22q11DS patients as well as in the general population.