ABSTRACT We report and evaluated a microflow, single-shot, short gradient SWATH MS method intended to accelerate the discovery and verification of protein biomarkers in clinical specimens. The method uses 15-min gradient microflow-LC peptide separation, an optimized SWATH MS window configuration and OpenSWATH software for data analysis. We applied the method to a cohort 204 of FFPE prostate tissue samples from 58 prostate cancer patients and 10 prostatic hyperplasia patients. Altogether we identified 27,976 proteotypic peptides and 4,043 SwissProt proteins from these 204 samples. Compared to a reference SWATH method with 2-hour gradient the accelerated method consumed only 27% instrument time, quantified 80% proteins and showed reduced batch effects. 3,800 proteins were quantified by both methods in two different instruments with relatively high consistency (r = 0.77). 75 proteins detected by the accelerated method with differential abundance between clinical groups were selected for further validation. A shortlist of 134 selected peptide precursors from the 75 proteins were analyzed using MRM-HR, exhibiting high quantitative consistency with the 15-min SWATH method (r = 0.89) in the same sample set. We further verified the capacity of these 75 proteins in separating benign and malignant tissues (AUC = 0.99) in an independent prostate cancer cohort (n=154). Overall our data show that the single-shot short gradient microflow-LC SWATH MS method achieved about 4-fold acceleration of data acquisition with reduced batch effect and a moderate level of protein attrition compared to a standard SWATH acquisition method. Finally, the results showed comparable ability to separate clinical groups.

Epithelial ovarian cancer (EOC) is a deadly disease with limited diagnostic biomarkers and therapeutic targets. Here we conduct a comprehensive proteomic profiling of ovarian tissue and plasma samples from 813 patients with different histotypes and therapeutic regimens, covering the expression of 10,715 proteins. We identify eight proteins associated with tumor malignancy in the tissue specimens, which are further validated as potential circulating biomarkers in plasma. Targeted proteomics assays are developed for 12 tissue proteins and 7 blood proteins, and machine learning models are constructed to predict one-year recurrence, which are validated in an independent cohort. These findings contribute to the understanding of EOC pathogenesis and provide potential biomarkers for early detection and monitoring of the disease. Additionally, by integrating mutation analysis with proteomic data, we identify multiple proteins related to DNA damage in recurrent resistant tumors, shedding light on the molecular mechanisms underlying treatment resistance. This study provides a multi-histotype proteomic landscape of EOC, advancing our knowledge for improved diagnosis and treatment strategies. It remains essential to find clinically relevant biomarkers in epithelial ovarian cancer (EOC). Here, the authors perform a comprehensive proteomic profiling of tissue and plasma samples from EOC and control patients; they find potential biomarkers for EOC early detection and develop methods for tumour recurrence prediction.

Abstract Data-independent acquisition (DIA) technology for protein identification from mass spectrometry and related algorithms is developing rapidly. The spectrum-centric analysis of DIA data without the use of spectra library from data-dependent acquisition (DDA) data represents a promising direction. In this paper, we proposed an untargeted analysis method, Dear-DIA XMBD , for direct analysis of DIA data. Dear-DIA XMBD first integrates the deep variational autoencoder and triplet loss to learn the representations of the extracted fragment ion chromatograms, then uses the k-means clustering algorithm to aggregate fragments with similar representations into the same classes, and finally establishes the inverted index tables to determine the precursors of fragment clusters between precursors and peptides, and between fragments and peptides. We show that Dear-DIA XMBD performs superiorly with the highly complicated DIA data of different species obtained by different instrument platforms. Dear-DIA XMBD is publicly available at https://github.com/jianweishuai/Dear-DIA-XMBD .

Abstract Thyroid nodules occur in about 60% of the population. Current diagnostic strategies, however, often fail at distinguishing malignant nodules before surgery, thus leading to unnecessary, invasive treatments. As proteins are involved in all physio/pathological processes, a proteome investigation of biopsied nodules may help correctly classify and identify malignant nodules and discover therapeutic targets. Quantitative mass spectrometry data-independent acquisition (DIA) enables highly reproducible and rapid throughput investigation of proteomes. An exhaustive spectral library of thyroid nodules is essential for DIA yet still unavailable. This study presents a comprehensive thyroid spectral library covering five types of thyroid tissue: multinodular goiter, follicular adenoma, follicular and papillary thyroid carcinoma, and normal thyroid tissue. Our library includes 925,330 transition groups, 157,548 peptide precursors, 121,960 peptides, 9941 protein groups, and 9826 proteins from proteotypic peptides. This library resource was evaluated using three papillary thyroid carcinoma samples and their corresponding adjacent normal thyroid tissue, leading to effective quantification of up to 7863 proteins from biopsy-level thyroid tissues.

The ongoing pandemic of the coronavirus disease 2019 (COVID-19) caused by the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) still has limited treatment options partially due to our incomplete understanding of the molecular dysregulations of the COVID-19 patients. We aimed to generate a repository and data analysis tools to examine the modulated proteins underlying COVID-19 patients for the discovery of potential therapeutic targets and diagnostic biomarkers.We built a web server containing proteomic expression data from COVID-19 patients with a toolset for user-friendly data analysis and visualization. The web resource covers expert-curated proteomic data from COVID-19 patients published before May 2022. The data were collected from ProteomeXchange and from select publications via PubMed searches and aggregated into a comprehensive dataset. Protein expression by disease subgroups across projects was compared by examining differentially expressed proteins. We also visualize differentially expressed pathways and proteins. Moreover, circulating proteins that differentiated severe cases were nominated as predictive biomarkers.We built and maintain a web server COVIDpro ( https://www.guomics.com/covidPro/ ) containing proteomics data generated by 41 original studies from 32 hospitals worldwide, with data from 3077 patients covering 19 types of clinical specimens, the majority from plasma and sera. 53 protein expression matrices were collected, for a total of 5434 samples and 14,403 unique proteins. Our analyses showed that the lipopolysaccharide-binding protein, as identified in the majority of the studies, was highly expressed in the blood samples of patients with severe disease. A panel of significantly dysregulated proteins was identified to separate patients with severe disease from non-severe disease. Classification of severe disease based on these proteomic signatures on five test sets reached a mean AUC of 0.87 and ACC of 0.80.COVIDpro is an online database with an integrated analysis toolkit. It is a unique and valuable resource for testing hypotheses and identifying proteins or pathways that could be targeted by new treatments of COVID-19 patients.National Key R&D Program of China: Key PDPM technologies (2021YFA1301602, 2021YFA1301601, 2021YFA1301603), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation for Distinguished Young Scholars (LR19C050001), Hangzhou Agriculture and Society Advancement Program (20190101A04), National Natural Science Foundation of China (81972492) and National Science Fund for Young Scholars (21904107), National Resource for Network Biology (NRNB) from the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS-P41 GM103504).Evidence before this study: Although an increasing number of therapies against COVID-19 are being developed, they are still insufficient, especially with the rise of new variants of concern. This is partially due to our incomplete understanding of the disease’s mechanisms. As data have been collected worldwide, several questions are now worth addressing via meta-analyses. Most COVID-19 drugs function by targeting or affecting proteins. Effectiveness and resistance to therapeutics can be effectively assessed via protein measurements. Empowered by mass spectrometry-based proteomics, protein expression has been characterized in a variety of patient specimens, including body fluids (e.g., serum, plasma, urea) and tissue (i.e., formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE)). We expert-curated proteomic expression data from COVID-19 patients published before May 2022, from the largest proteomic data repository ProteomeXhange as well as from literature search engines. Using this resource, a COVID-19 proteome meta-analysis could provide useful insights into the mechanisms of the disease and identify new potential drug targets.Added value of this study: We integrated many published datasets from patients with COVID-19 from 11 nations, with over 3000 patients and more than 5434 proteome measurements. We collected these datasets in an online database, and generated a toolbox to easily explore, analyze, and visualize the data. Next, we used the database and its associated toolbox to identify new proteins of diagnostic and therapeutic value for COVID-19 treatment. In particular, we identified a set of significantly dysregulated proteins for distinguishing severe from non-severe patients using serum samples.Implications of all the available evidence: COVIDpro will support the navigation and analysis of patterns of dysregulated proteins in various COVID-19 clinical specimens for identification and verification of protein biomarkers and potential therapeutic targets.

Many tumors are characterized by large genomic heterogeneity and it remains unclear to what extent this impacts on protein biomarker discovery. Here, we quantified proteome intra-tissue heterogeneity (ITH) based on a multi-region analysis of 30 biopsy-scale prostate tissues using pressure cycling technology and SWATH mass spectrometry. We quantified 8,248 proteins and analyzed the ITH of 3,700 proteins. The level of ITH varied significantly depending on proteins and tissue types. Benign tissues exhibited generally more complex ITH patterns than malignant tissues. Spatial variability of ten prostate biomarkers was further validated by immunohistochemistry in an independent cohort (n=83) using tissue microarrays. PSA was preferentially variable in benign prostatic hyperplasia, while GDF15 substantially varied in prostate adenocarcinomas. Further, we found that DNA repair pathways exhibited a high degree of variability in tumorous tissues, which may contribute to the genetic heterogeneity of tumors. This study conceptually adds a new perspective to protein biomarker discovery by quantifying spatial proteome variation and it demonstrates the feasibility by exploiting recent technological progress.

ABSTRACT Aging is the result of the accumulation of molecular damages that impair normal biochemical activities. We previously reported that aging-damaged amino acid sequence NGR (Asn-Gly-Arg) results in a ‘gain-of-function’ conformational switching to isoDGR (isoAsp-Gly-Arg) motif. This integrin-binding motif activates leukocytes to induce chronic inflammation, which are characteristic features of age-linked cardiovascular disorders. We now report that anti-isoDGR immunotherapy doubles lifespan in mouse model of chronic inflammation. We observed extensive accumulation of isoDGR and inflammatory cytokine expression in multiple tissues from Pcmt1-KO and old WT animals, which could also be induced via injection of isoDGR-modified plasma proteins or synthetic peptides into young WT animals. However, weekly injection of anti-isoDGR mAb (1mg/kg) was sufficient to significantly reduce isoDGR-modified proteins and pro-inflammatory cytokine expression, improve behaviour and coordination, and double the average lifespan of Pcmt1-KO mice. Mechanistically, isoDGR-mAb mediated the immune clearance of damaged isoDGR-proteins by antibody-dependent cellular phagocytosis. These results indicate that immunotherapy targeting aging-damaged proteins may represent effective interventions for a range of age-linked degenerative disorders. Graphical Abstract Anti-isoDGR immunotherapy induces immune clearance of aging damaged isoDGR-proteins to reduce chronic inflammation, improve behaviour and coordination, and double lifespan in PCMT -/- mice.

In this study, we optimized the pressure-cycling technology (PCT) and SWATH mass spectrometry workflow to analyze biopsy-level tissue samples (2 mg wet weight) from 19 hepatocellular carcinoma (HCC) patients. Using OpenSWATH and pan-human spectral library, we quantified 11,787 proteotypic peptides from 2,579 SwissProt proteins in 76 HCC tissue samples within about 9 working days (from receiving tissue to SWATH data). The coefficient of variation (CV) of peptide yield using PCT was 32.9%, and the R2 of peptide quantification was 0.9729. We identified protein changes in malignant tissues compared to matched control samples in HCC patients, and further stratified patient samples into groups with high α-fetoprotein (AFP) expression or HBV infection. In aggregate, the data identified 23 upregulated pathways and 13 ones. We observed enhanced biomolecule synthesis and suppressed small molecular metabolism in liver tumor tissues. 16 proteins of high documented relevance to HCC are highlighted in our data. We also identified changes of virus-infection-related proteins including PKM, CTPS1 and ALDOB in the HBV+ HCC subcohort. In conclusion, we demonstrate the practicality of performing proteomic analysis of biopsy-level tissue samples with PCT-SWATH methodology with moderate effort and within a relatively short timeframe.

An inherent bottleneck of data independent acquisition (DIA) analysis by Orbitrap-based mass spectrometers is the relatively large window width due to the relatively slow scanning rate compared to TOF. Here we present a novel gas phase separation and MS acquisition method called PulseDIA-MS, which improves the specificity and sensitivity of Orbitrap-based DIA analysis. This is achieved by dividing the ordinary DIA-MS analysis covering the entire mass range into multiple injections for DIA-MS analyses with complementary windows. Using standard HeLa digests, the PulseDIA method identified 69,530 peptide precursors from 9,337 protein groups with ten MS injections of 30 min LC gradient. The PulseDIA scheme containing two complementary windows led to the highest gain of peptide and protein identifications per time unit compared to the conventional 30 min DIA method. We further applied the method to profile the proteome of 18 cholangiocarcinoma (CCA) tissue samples (benign and malignant) from nine patients. PulseDIA identified 7,796 protein groups in these CCA samples, with 14% increase of protein identifications, compared to the conventional DIA method. The missing value for protein matrix dropped by 7% with PulseDIA acquisition. 681 proteins were significantly dysregulated in tumorous CCA samples. Together, we presented and benchmarked an alternative DIA method with higher sensitivity and lower missing rate.

Summary A comprehensive pan-human spectral library is critical for biomarker discovery using mass spectrometry (MS)-based proteomics. DPHL v1, a previous pan-human library built from 1096 data-dependent acquisition (DDA) MS data of 16 human tissue types, allows quantifying 10,943 proteins. However, a major limitation of DPHL v1 is the lack of semi-tryptic peptides and protein isoforms, which are abundant in clinical specimens. Here, we generated DPHL v2 from 1608 DDA-MS data acquired using Orbitrap mass spectrometers. The data included 586 DDA-MS newly acquired from 17 tissue types, while 1022 files were derived from DPHL v1. DPHL v2 thus comprises data from 24 sample types, including several cancer types (lung, breast, kidney, and prostate cancer, among others). We generated four variants of DPHL v2 to include semi-tryptic peptides and protein isoforms. DPHL v2 was then applied to a publicly available colorectal cancer dataset with 286 DIA-MS files. The numbers of identified and significantly dysregulated proteins increased by at least 21.7% and 14.2%, respectively, compared with DPHL v1. Our findings show that the increased human proteome coverage of DPHL v2 provides larger pools of potential protein biomarkers.