Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a highly metastatic disease. Tumors are poorly immunogenic and immunosuppressive, preventing T cell activation in the tumor microenvironment. Here, we present a microbial-based immunotherapeutic treatment for selective delivery of an immunogenic tetanus toxoid protein (TT856-1313) into PDAC tumor cells by attenuated Listeria monocytogenes. This treatment reactivated preexisting TT-specific memory T cells to kill infected tumor cells in mice. Treatment of KrasG12D,p53R172H, Pdx1-Cre (KPC) mice with Listeria-TT resulted in TT accumulation inside tumor cells, attraction of TT-specific memory CD4 T cells to the tumor microenvironment, and production of perforin and granzyme B in tumors. Low doses of gemcitabine (GEM) increased immune effects of Listeria-TT, turning immunologically cold into hot tumors in mice. In vivo depletion of T cells from Listeria-TT + GEM-treated mice demonstrated a CD4 T cell-mediated reduction in tumor burden. CD4 T cells from TT-vaccinated mice were able to kill TT-expressing Panc-02 tumor cells in vitro. In addition, peritumoral lymph node-like structures were observed in close contact with pancreatic tumors in KPC mice treated with Listeria-TT or Listeria-TT + GEM. These structures displayed CD4 and CD8 T cells producing perforin and granzyme B. Whereas CD4 T cells efficiently infiltrated the KPC tumors, CD8 T cells did not. Listeria-TT + GEM treatment of KPC mice with advanced PDAC reduced tumor burden by 80% and metastases by 87% after treatment and increased survival by 40% compared to nontreated mice. These results suggest that Listeria-delivered recall antigens could be an alternative to neoantigen-mediated cancer immunotherapy.

ABSTRACT Pancreatic ductal adenocarcinoma is highly metastatic, poorly immunogenic, and immune suppression prevents T cell activation in the tumor microenvironment. We developed a microbial-based immunotherapeutic concept for selective delivery of a highly immunogenic tetanus toxoid protein (TT 856-1313 ), into tumor cells by attenuated Listeria monocytogenes , and reactivation of pre-existing TT-specific memory T cells (generated during childhood) to kill infected tumor cells. Thus, TT here functions as an alternative for neoantigens. Treatment of KPC mice with Listeria -TT resulted in TT accumulation in tumors and inside tumor cells, and attraction of predominantly TT-specific memory CD4 T cells. Moreover, gemcitabine (GEM) combined with Listeria-TT significantly improved the migration of CD4 T cells into tumors and the production of perforin and granzyme B, turning cold tumors into immunological hot tumors. In vivo depletion of T cells in Listeria-TT+GEM-treated mice demonstrated CD4 T cell-mediated eradication of tumors and metastases (Mann-Whitney p<0.05). In addition, peritumoral lymph node like structures (LNS) were observed in close contact with the pancreatic tumors displaying CD4 T cells and CD8 T cells of KPC mice treated with Listeria -TT or Listeria -TT+GEM. The production of perforin and granzyme B was observed in LNS of KPC mice that received Listeria -TT+GEM. This combination not only reduced tumor burden (80%) and metastases (87%) significantly (p<0.05, Mann-Whitney), but also improved the survival time of KPC mice with advanced pancreatic cancer substantially (Mantel-Cox p<0.0001). Our results unveil new mechanisms of Listeria and GEM improving immunotherapy for PDAC.

ABSTRACT Objective Oncogenic “hotspot” mutations of KRAS and GNAS are two major driver alterations in Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms (IPMNs), which are bona fide precursors to pancreatic ductal adenocarcinoma. We previously reported that pancreas-specific Kras G12D and Gnas R201C co-expression in p48 Cre ; Kras LSL-G12D ; Rosa26 LSL-rtTA ; Tg (TetO- Gnas R201C ) mice (“ Kras;Gnas ” mice) caused development of cystic lesions recapitulating IPMNs. Here, we aim to unveil the consequences of mutant Gnas R201C expression on phenotype, transcriptomic profile, and genomic dependencies. Design We performed multimodal transcriptional profiling (bulk RNA sequencing, single cell RNA sequencing, and spatial transcriptomics) in the “ Kras;Gnas” autochthonous model and tumor-derived cell lines ( Kras;Gnas cells), where Gnas R201C expression is inducible. A genome-wide CRISPR/ Cas 9 screen was conducted to identify potential vulnerabilities in Kras G12D ;Gnas R201C co-expressing cells. Results Induction of Gnas R201C – and resulting G (s) alpha signaling – leads to the emergence of a gene signature of gastric (pyloric type) metaplasia in pancreatic neoplastic epithelial cells. CRISPR screening identified the synthetic essentiality of glycolysis-related genes Gpi1 and Slc2a1 in Kras G12D ; Gnas R201C co-expressing cells. Real-time metabolic analyses in Kras;Gnas cells and autochthonous Kras;Gnas model confirmed enhanced glycolysis upon Gnas R201C induction. Induction of Gnas R201C made Kras G12D expressing cells more dependent on glycolysis for their survival. Protein kinase A-dependent phosphorylation of the glycolytic intermediate enzyme PFKFB3 was a driver of increased glycolysis upon Gnas R201C induction. Conclusion Multiple orthogonal approaches demonstrate that Kras G12D and Gnas R201C co-expression results in a gene signature of gastric pyloric metaplasia and glycolytic dependency during IPMN pathogenesis. The observed metabolic reprogramming may provide a potential target for therapeutics and interception of IPMNs. SUMMARY What is already known on this topic Activating “hotspot” mutations of KRAS and GNAS are found in a majority of Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms (IPMNs). Expression of mutant KRAS and GNAS drives development of IPMN-like cystic lesions in the murine pancreas that eventually progress to pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). What this study adds Mutant GNAS and the resulting aberrant G (s) alpha signaling drives a transcriptional signature of gastric (pyloric type) metaplasia in IPMNs with mucin production. Aberrant G (s) alpha signaling enhances glycolysis via protein kinase A-dependent phosphorylation of the glycolytic enzyme PFKFB3. Enhanced glycolysis in KRAS;GNAS -mutated IPMN cells is validated via multiple orthogonal approaches in vitro and in vivo and represents an actionable metabolic vulnerability. How this study might affect research, practice or policy The present study provides mechanistic insight into how aberrant G (s) alpha signaling alters the biology of Kras -mutant pancreatic epithelial neoplasia through metaplastic and metabolic reprogramming. Targeting glycolysis in IPMNs may represent both a therapeutic avenue as well as an opportunity for intercepting progression to invasive cancer.

Oncogenic 'hotspot' mutations of

ABSTRACT Treatments for pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) are poorly effective, at least partly due to the tumor’s immune-suppressive stromal compartment. New evidence of positive effects on immune responses in the tumor microenvironment, compelled us to test the combination of gemcitabine (GEM), a standard chemotherapeutic for pancreatic cancer, with nicotinamide (NAM), the amide form of niacin (vitamin B3), in various mouse tumor models of pancreatic cancer, i.e. peritoneal or orthotopic of Panc-02 (Kras G12D ) and orthotopic KPC (Kras G12D , p53 R172H , Pdx1-Cre) grafts. A significant reduction in tumor weight and number of metastases was found, as well as a significant improved survival of the NAM+GEM group compared to all control groups. Immunohistochemistry and flow cytometry of pancreatic tumors showed a significant decrease in tumor-associated macrophages (TAM) and myeloid-derived suppressor cells (MDSC), an increase in the number of CD4 and CD8 T cells and the production of granzyme B in the NAM+GEM group. Moreover, T cell responses to tumor-associated antigen survivin were observed in spleens of the mice that received NAM+GEM but not in those that received single agents or saline. In addition, remodeling of the tumor stroma was observed with decreased collagen I and expression of hyaluronic acid binding protein, reorganization of the immune cells into lymph node like structures, and CD31 positive vessels. Expression profiling for a panel of immuno-oncology genes revealed significant changes in genes involved in migration and activation of T cells, attraction of dendritic cells, and epitope spreading. This study highlights the potential of NAM+GEM as immunotherapy for advanced pancreatic cancer.