On 3 January 2000, the Galileo spacecraft passed close to Europa when it was located far south of Jupiter's magnetic equator in a region where the radial component of the magnetospheric magnetic field points inward toward Jupiter. This pass with a previously unexamined orientation of the external forcing field distinguished between an induced and a permanent magnetic dipole moment model of Europa's internal field. The Galileo magnetometer measured changes in the magnetic field predicted if a current-carrying outer shell, such as a planet-scale liquid ocean, is present beneath the icy surface. The evidence that Europa's field varies temporally strengthens the argument that a liquid ocean exists beneath the present-day surface.

Single-molecule localization microscopy (SMLM) describes a family of powerful imaging techniques that dramatically improve spatial resolution over standard, diffraction-limited microscopy techniques and can image biological structures at the molecular scale. In SMLM, individual fluorescent molecules are computationally localized from diffraction-limited image sequences and the localizations are used to generate a super-resolution image or a time course of super-resolution images, or to define molecular trajectories. In this Primer, we introduce the basic principles of SMLM techniques before describing the main experimental considerations when performing SMLM, including fluorescent labelling, sample preparation, hardware requirements and image acquisition in fixed and live cells. We then explain how low-resolution image sequences are computationally processed to reconstruct super-resolution images and/or extract quantitative information, and highlight a selection of biological discoveries enabled by SMLM and closely related methods. We discuss some of the main limitations and potential artefacts of SMLM, as well as ways to alleviate them. Finally, we present an outlook on advanced techniques and promising new developments in the fast-evolving field of SMLM. We hope that this Primer will be a useful reference for both newcomers and practitioners of SMLM.

Accelerating PALM/STORM microscopy with deep learning allows super-resolution imaging of >1,000 cells in a few hours. The speed of super-resolution microscopy methods based on single-molecule localization, for example, PALM and STORM, is limited by the need to record many thousands of frames with a small number of observed molecules in each. Here, we present ANNA-PALM, a computational strategy that uses artificial neural networks to reconstruct super-resolution views from sparse, rapidly acquired localization images and/or widefield images. Simulations and experimental imaging of microtubules, nuclear pores, and mitochondria show that high-quality, super-resolution images can be reconstructed from up to two orders of magnitude fewer frames than usually needed, without compromising spatial resolution. Super-resolution reconstructions are even possible from widefield images alone, though adding localization data improves image quality. We demonstrate super-resolution imaging of >1,000 fields of view containing >1,000 cells in ∼3 h, yielding an image spanning spatial scales from ∼20 nm to ∼2 mm. The drastic reduction in acquisition time and sample irradiation afforded by ANNA-PALM enables faster and gentler high-throughput and live-cell super-resolution imaging.

Confocal laser scanning microscopy is a powerful and popular technique for 3D imaging of biological specimens. Although confocal microscopy images are much sharper than standard epifluorescence ones, they are still degraded by residual out-of-focus light and by Poisson noise due to photon-limited detection. Several deconvolution methods have been proposed to reduce these degradations, including the Richardson-Lucy iterative algorithm, which computes maximum likelihood estimation adapted to Poisson statistics. As this algorithm tends to amplify noise, regularization constraints based on some prior knowledge on the data have to be applied to stabilize the solution. Here, we propose to combine the Richardson-Lucy algorithm with a regularization constraint based on Total Variation, which suppresses unstable oscillations while preserving object edges. We show on simulated and real images that this constraint improves the deconvolution results as compared with the unregularized Richardson-Lucy algorithm, both visually and quantitatively.

et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Live-cell imaging has revealed unexpected features of gene expression. Here using improved single-molecule RNA microscopy, we show that synthesis of HIV-1 RNA is achieved by groups of closely spaced polymerases, termed convoys, as opposed to single isolated enzymes. Convoys arise by a Mediator-dependent reinitiation mechanism, which generates a transient but rapid succession of polymerases initiating and escaping the promoter. During elongation, polymerases are spaced by few hundred nucleotides, and physical modelling suggests that DNA torsional stress may maintain polymerase spacing. We additionally observe that the HIV-1 promoter displays stochastic fluctuations on two time scales, which we refer to as multi-scale bursting. Each time scale is regulated independently: Mediator controls minute-scale fluctuation (convoys), while TBP-TATA-box interaction controls sub-hour fluctuations (long permissive/non-permissive periods). A cellular promoter also produces polymerase convoys and displays multi-scale bursting. We propose that slow, TBP-dependent fluctuations are important for phenotypic variability of single cells.

Actin-based motility is used by various pathogens for dissemination within and between cells. Yet host factors restricting this process have not been identified. Septins are GTP-binding proteins that assemble as filaments and are essential for cell division. However, their role during interphase has remained elusive. Here, we report that septin assemblies are recruited to different bacteria that polymerize actin. We observed that intracytosolic Shigella either become compartmentalized in septin cage-like structures or form actin tails. Inactivation of septin caging increases the number of Shigella with actin tails and enhances cell-to-cell spread. TNF-α, a host cytokine produced upon Shigella infection, stimulates septin caging and restricts actin tail formation and cell-to-cell spread. Finally, we show that septin cages entrap bacteria targeted to autophagy. Together, these results reveal an unsuspected mechanism of host defense that restricts dissemination of invasive pathogens.

Abstract Regulation of RNA abundance and localization is a key step in gene expression control. Single-molecule RNA fluorescence in-situ hybridization (smFISH) is a widely used single-cell-single-molecule imaging technique enabling a quantitative understanding of gene expression and its regulatory mechanisms. Recent progress in experimental techniques provides larger data-sets, requiring adequate tools for data analysis and exploration. Here, we present FISH-quant v2, a highly modular analysis tool accessible both for non-experts and experts, which we validated and applied on large-scale smFISH image datasets. Our package allows the user to detect isolated and clustered mRNA spots, segment nuclei and cells, quantify RNA localization patterns and visualize these results at the single-cell level.

Abstract The current COVID-19 pandemic is caused by the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). The positive-sense single-stranded RNA virus contains a single linear RNA segment that serves as a template for transcription and replication, leading to the synthesis of positive and negative-stranded viral RNA (vRNA) in infected cells. Tools to visualize viral RNA directly in infected cells are critical to analyze its replication cycle, screen for therapeutic molecules or study infections in human tissue. Here, we report the design, validation and initial application of fluorescence in situ hybridization (FISH) probes to visualize positive or negative RNA of SARS-CoV-2 (CoronaFISH). We demonstrate sensitive visualization of vRNA in African green monkey and several human cell lines, in patient samples and human tissue. We further demonstrate the adaptation of CoronaFISH probes to electron microscopy (EM). We provide all required oligonucleotide sequences, source code to design the probes, and a detailed protocol. We hope that CoronaFISH will complement existing techniques for research on SARS-CoV-2 biology and COVID-19 pathophysiology, drug screening and diagnostics.