Abstract Haploinsufficiency of the CACNA1A gene, encoding the pore-forming α1 subunit of P/Q-type voltage-gated calcium channels, is associated with a clinically variable phenotype ranging from cerebellar ataxia, to neurodevelopmental syndromes with epilepsy and intellectual disability. To understand the pathological mechanisms of CACNA1A loss-of-function variants, we characterized a human neuronal model for CACNA1A haploinsufficiency, by differentiating isogenic induced pluripotent stem cell lines into glutamatergic neurons, and investigated the effect of CACNA1A haploinsufficiency on mature neuronal networks through a combination of electrophysiology, gene expression analysis, and in silico modeling. We observed an altered network synchronization in CACNA1A +/− networks alongside synaptic deficits, notably marked by an augmented contribution of GluA2-lacking AMPA receptors. Intriguingly, these synaptic perturbations coexisted with increased non-synaptically driven activity, as characterized by inhibition of NMDA and AMPA receptors on micro-electrode arrays. Single-cell electrophysiology and gene expression analysis corroborated this increased intrinsic excitability through reduced potassium channel function and expression. Moreover, we observed partial mitigation of the CACNA1A +/− network phenotype by 4-aminopyridine, a therapeutic intervention for episodic ataxia type 2. In summary, our study pioneers the characterization of a human induced pluripotent stem cell-derived neuronal model for CACNA1A haploinsufficiency, and has unveiled novel mechanistic insights. Beyond showcasing synaptic deficits, this neuronal model exhibited increased intrinsic excitability mediated by diminished potassium channel function, underscoring its potential as a therapeutic discovery platform with predictive validity.

SGIP1 encodes a protein Src homology 3-domain growth factor receptor-bound 2-like endophilin interacting protein 1. It is involved in the regulation of clathrin-mediated endocytosis along with having a role in energy homeostasis in neuronal systems. We generated an isogenic human induced pluripotent stem cell (iPSC) line with a biallelic frameshift variant in SGIP1. This exon has been shown to be subject to alternative splicing, leading to an isoform lacking 24 amino acids that are present in the longest SGIP isoform. The newly generated iPSC line will be helpful to dissect the differential properties of the two SGIP isoforms.

Abstract Astrocytes play a pivotal role in neuronal network development. Despite the well-known role of astrocytes in the pathophysiology of neurologic disorders, the utilization of human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived astrocytes in neuronal networks remains limited. Here, we present a streamlined one-step protocol for the differentiation of hiPSCs directly into functional astrocytes without the need for ectopic gene expression or neural progenitor cell generation. We found that culturing hiPSCs directly in commercial astrocyte medium, was sufficient to differentiate hiPSCs into functional astrocytes within five weeks. Validation to varying extents across thirty hiPSC-lines demonstrated consistent astrocyte differentiation with minimal batch-to-batch variability. We confirmed astrocyte identity and functionality of the hiPSC-astrocyte monocultures by immunofluorescence, flowcytometry, RNA sequencing, glutamate uptake assays and calcium signaling recordings. Optimization of the protocol enabled co-culture of hiPSC-astrocytes with Ngn2 hiPSC-derived neurons (iNeurons), promoting neuronal differentiation and synapse formation. Lastly, we used single-cell electrophysiology and multi-electrode arrays to confirm robust neuronal network development in 5-week-old hiPSC-astrocyte and iNeuron co-cultures. This protocol offers a rapid and efficient method to establish all-human astrocyte-neuron co-cultures, facilitating the investigation of cell-type-specific contributions to disease pathogenesis. While validated across multiple hiPSC lines, we actively encourage researchers to test and provide feedback on this protocol to enhance its validation for future iterations.