Abstract The type-V CRISPR effector Cas12i, with its smaller size, short crRNA guiding, and self-processing features, is a potentially versatile genome editing tool. By screening Cas12i proteins from a metagenomic database, we identified a natural variant with high activity in mammalian cells, named as xCas12i. We further engineered the PAM-interacting, REC, and RuvC domains for enhanced cleavage activity and specificity. This variant, named as high-fidelity Cas12Max, exhibited robust genome editing activity and minimal off-target activity with a broad 5’-TN recognition profile. With the fusion of deaminase TadA8e and further optimization of xCas12i, the base editor dCas12i-Tad8e also showed the high editing efficiency. This study provides highly efficient and specific tools for gene therapy.

Abstract LncRNAs are involved in modulating the individual risk and the severity of progression in metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MASLD), but their precise roles remain largely unknown. This study aimed to investigate the role of lncRNA Snhg3 in the development and progression of MASLD, along with the underlying mechanisms. In vitro and in vivo experiments revealed that Snhg3 is involved in lipid metabolism and steatosis. The result showed that Snhg3 was significantly downregulated in the liver of high-fat diet-induced obesity (DIO) mice. Notably, palmitic acid promoted the expression of Snhg3 and overexpression of Snhg3 increased lipid accumulation in primary hepatocytes. Furthermore, hepatocyte-specific Snhg3 deficiency decreased body and liver weight, alleviated hepatic steatosis and promoted hepatic fatty acid metabolism in DIO mice, whereas overexpression induced the opposite effect. Mechanistically, Snhg3 promoted the expression, stability and nuclear localization of SND1 protein via interacting with SND1, thereby inducing K63-linked ubiquitination modification of SND1. Moreover, Snhg3 decreased the H3K27me3 level and induced SND1-mediated chromatin loose remodeling, thus reducing H3K27me3 enrichment at the Ppar γ promoter and enhancing Ppar γ expression. The administration of PPARγ inhibitor T0070907 improved Snhg3 -aggravated hepatic steatosis. Our study revealed a new signaling pathway, Snhg3 /SND1/H3K27me3/PPARγ, responsible for MASLD and indicates that lncRNA-mediated epigenetic modification has a crucial role in the pathology of MASLD.

Abstract Transposon-associated ribonucleoprotein TnpB is known to be the ancestry endonuclease of diverse Cas12 effector proteins from type-V CRISPR system. Given its small size (409 aa), it is of interest to examine whether engineered TnpB could be used for efficient mammalian genome editing. Here, we showed that the gene editing activity of native TnpB in mouse embryos was already higher than previously identified small-sized Cas12f1. Further stepwise engineering of noncoding RNA (ωRNA or reRNA) component of TnpB significantly elevated the nuclease activity of TnpB. Notably, an optimized TnpB-ωRNA system could be efficiently delivered in vivo with single adeno-associated virus (AAV) and prevented the disease phenotype in a tyrosinaemia mouse model. Thus, the engineered miniature TnpB system represents a new addition to the current genome editing toolbox, with the unique feature of the smallest effector size that facilitate efficient AAV delivery for editing of cells and tissues.