Prochlorococcus marinus , the dominant photosynthetic organism in the ocean, is found in two main ecological forms: high-light-adapted genotypes in the upper part of the water column and low-light-adapted genotypes at the bottom of the illuminated layer. P. marinus SS120, the complete genome sequence reported here, is an extremely low-light-adapted form. The genome of P. marinus SS120 is composed of a single circular chromosome of 1,751,080 bp with an average G+C content of 36.4%. It contains 1,884 predicted protein-coding genes with an average size of 825 bp, a single rRNA operon, and 40 tRNA genes. Together with the 1.66-Mbp genome of P. marinus MED4, the genome of P. marinus SS120 is one of the two smallest genomes of a photosynthetic organism known to date. It lacks many genes that are involved in photosynthesis, DNA repair, solute uptake, intermediary metabolism, motility, phototaxis, and other functions that are conserved among other cyanobacteria. Systems of signal transduction and environmental stress response show a particularly drastic reduction in the number of components, even taking into account the small size of the SS120 genome. In contrast, housekeeping genes, which encode enzymes of amino acid, nucleotide, cofactor, and cell wall biosynthesis, are all present. Because of its remarkable compactness, the genome of P. marinus SS120 might approximate the minimal gene complement of a photosynthetic organism.

Abstract In cyanobacteria DNA supercoiling varies over the diurnal light/dark cycle and is integrated with the circadian transcription program and (Woelfle et al. [2007], Vijayan et al. [2009], PNAS). Specifically, Woelfle et al . have reported that DNA supercoiling of an endogenous plasmid became progressively higher during prolonged dark phases in Synechococcus elongatus PCC 7942. This is counterintuitive, since higher levels of negative DNA supercoiling are commonly associated with exponential growth and high metabolic flux. Vijayan et al . then have reverted the interpretation of plasmid mobility on agarose gels supplemented with chloroquine diphosphate (CQ), but not further discussed the differences. Here, we set out to clarify this open issue in cyanobacterial DNA supercoiling dynamics. We first re-capitulate Keller’s band counting method (1975, PNAS) using CQ instead of ethidium bromide as the intercalating agent. A 500x–1000x higher CQ concentration is required in the DNA relaxation reaction (topoisomerase I) than in the agarose gel buffer to quench all negative supercoiling of pUC19 extracted from Escherichia coli . This is likely due to the dependence of both, the DNA binding affinity of CQ and the induced DNA unwinding angle, on the ionic strength of the buffer. Lower levels of CQ were required to fully relax in vivo pUC19 supercoiling than were used by Woelfle et al . Next, we analyzed the in vivo supercoiling of endogenous plasmids of Synechocystis sp. PCC 6803, at two different CQ concentrations. These experiments indicate that negative supercoiling of plasmids does not increase but decreases in the dark phase, and progressively decreases further in prolonged darkness.

Abstract In cyanobacteria DNA supercoiling varies over the diurnal light/dark cycle and is integrated with temporal programs of transcription and replication. We manipulated DNA supercoiling in Synechocystis sp. PCC 6803 by CRISPRi-based knock-down of gyrase subunits and overexpression of topoisomerase I (TopoI), and characterized the phenotypes. Cell division was blocked, most likely due to inhibition of genomic but not plasmid DNA replication. Cell growth continued to 4-5x of the wildtype cell volume, and metabolic flux was redirected towards glycogen in the TopoI overexpression strain. TopoI induction initially lead to down-regulation of GC-rich and up-regulation of AT-rich genes. The response quickly bifurcated and four diurnal co-expression cohorts (dawn, noon, dusk and night) all responded differently, in part with a circadian ( ≈ 24 h) pattern. A GC-rich region − 50 bp of transcription start sites is differentially enriched in these four cohorts. We suggest a model where energy- and gyrase-gated transcription of growth genes at the dark/light transition (dawn) generates DNA supercoiling which then facilitates DNA replication and initiates the diurnal transcriptome program.

Abstract Metabolic oscillations are characterized by alternating phases of high and low respiratory activity, associated with transcription of genes involved in biosynthetic pathways and growth, and in catabolism and stress response. However, the functional consequences of transcriptome oscillations remain unclear, since most proteins are too stable to be affected by oscillatory transcript abundances. In this work, we investigate a transcriptome time series during an unstable state of the oscillation. Our analyses confirm previous suggestions that the relative times spent in the alternative transcription states are coupled to growth rate. This pulse-width modulation of transcription provides a simple mechanism for the long-standing question of how cells adjust their ribosome content and growth rate to environmental conditions. A mathematical model of this idea reproduces both the almost linear relation of transcript and protein abundances and the non-linear relation of oscillation periods to growth rate.

Abstract Organisms from all kingdoms of life have evolved diverse mechanisms to address the predictable environmental changes resulting from the Earth’s rotation. The circadian clock of cyanobacteria is a particularly simple and elegant example of a biological timing mechanism for predicting daily changes in the light environment. The three proteins KaiA, KaiB, and KaiC constitute the central timing mechanism that drives circadian oscillations in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. In addition to the standard oscillator, Synechocystis sp. PCC 6803, another model organism for cyanobacterial research, harbors several divergent clock homologs. Here, we describe a potential new chimeric KaiA homolog that we named KaiA3. At the N-terminus, KaiA3 is similar to the NarL-type response regulator receiver domain. However, its similarity to canonical NarL transcription factors drastically decreases in the C-terminal domain, which resembles the circadian clock protein, KaiA. In line with this, we detected KaiA3-mediated stimulation of KaiC3 phosphorylation. Phosphorylation of KaiC3 was rhythmic over 48 h in vitro in the presence of KaiA3 and KaiB3 as well as in Synechocystis cells under free-running conditions after light/dark entrainment. This results in the presence of two different oscillators in a single-celled prokaryotic organism. Deletion of the kaiA3 gene leads to KaiC3 dephosphorylation and results in growth defects during mixotrophic growth and in the dark. In summary, we suggest that KaiA3 is a nonstandard KaiA homolog, thereby extending the KaiB3-KaiC3 system in Cyanobacteria and potentially other prokaryotes.

A bstract Bioinformatics has established itself as a central pillar of modern biology. Specifically, comparative genomics enables scientists to study a vast number of genomes efficiently. These comparative analyses shed light on the evolution and potential function of genomes and genes, but are also increasingly used as a key tool for metabolic engineering and synthetic biology by identifying appropriate targets for modification. While numerous sophisticated tools for comparative genomics and homolog identification exist, those tools predominantly target highly skilled bioinformatics users. Consequently, many biologists either defer such analyses to their more versed bioinformatic collaborators or resort to suboptimal tools. Here, we present an intuitive solution available on all major operating systems, easily accessed through common web browsers. CATHI – Comparative Analysis Tool for Homolog Identification – integrates a suite of best-practice bioinformatic tools, encompassing BLAST for homology searches, MAFFT for multiple sequence alignment, FastTree2 for phylogeny reconstruction, and clinker for synteny analysis. Specifically tailored to biologists, CATHI orchestrates predefined settings and automated pipelines, obviating the need for programming expertise. This platform empowers researchers to confidently engage in detailed comparative genomics studies by streamlining the analytical process. The interactive framework provides users with a plethora of options. This includes real-time execution and progress monitoring, facilitates dynamic result tracking, and a set of search functions across NCBI databases like CDD or ProtFam. Users can interactively engage in data exploration, filtering, and visualization through CATHI’s intuitive interface. Furthermore, the seamless export of project data in standard formats (FASTA, Newick, CSV, and HTML) facilitates the integration with further third-party tools such as TreeViewer and Jalview. To benchmark CATHI, we revisited the comparative analysis of cyanobacterial circadian clock proteins conducted by Schmelling et al. in 2017, revealing consistent global patterns among identified homologs, while also highlighting individual variations attributed to the expansion of available databases.

A bstract The ß-proteobacterial species Curvibacter sp. AEP1-3 is a model organism for the study of symbiotic interactions as it is the most abundant bacterial colonizer of the basal metazoan Hydra vulgaris . Yet, genetic tools for Curvibacter are still in an infancy: few promoters have been characterized for Curvibacter . Here we employ an oligonucleotide based strategy to find potential expression systems derived from the genome of Curvibacter . Potential promoters were systematically mined from the genome in silico. The sequences were cloned as a mixed library into a mCherry reporter gene expression vector and single positive candidates were selected through Flow Cytometry based sorting to be further analyzed through bulk measurements. From 500 candidate sequences, 25 were identified as active promoters of varying expression strength levels. Bulk measurements revealed unique activity profiles for these sequences across growth phases. The expression levels of these promoters ranged over two orders of magnitudes and showed distinct temporal expression dynamics over the growth phases: while 3 sequences showed higher expression levels in the exponential phase than in the stationary phase, we found 12 sequences saturating expression during stationary phase and 10 that showed little discrimination between growth phases. From our library, promoters the genes encoding for DnaK, RpsL and an AHL synthase stood out as the most interesting candidates as their expression profiles fit a variety of applications. Examining the expression levels of successful candidates in relation to RNAseq read counts revealed only weak correlation between the two datasets. This underscores the importance of employing comprehensive high-throughput strategies when establishing expression systems for newly introduced model organisms.

Background: The 6S RNA is a global transcriptional riboregulator, which is exceptionally widespread among most bacterial phyla. While its role is well characterized in some heterotrophic bacteria, we subjected a cyanobacterial homolog to functional analysis, thereby extending the scope of 6S RNA action to the special challenges of photoautotrophic lifestyles. Results: Physiological characterization of a 6S RNA deletion strain (ΔssaA) demonstrates a delay in the recovery from nitrogen starvation. Significantly decelerated phycobilisome reassembly and glycogen degradation are accompanied with reduced photosynthetic activity compared to the wild type. Transcriptome profiling further revealed that predominantly genes encoding photosystem components, ATP synthase, phycobilisomes and ribosomal proteins were negatively affected in ΔssaA. In vivo pull-down studies of the RNA polymerase complex indicated a promoting effect of 6S RNA on the recruitment of the cyanobacterial housekeeping σ factor SigA, concurrently supporting dissociation of group 2 σ factors during recovery from nitrogen starvation. Conclusions: This study reveals 6S RNA as an integral part of the cellular response of Synechocystis sp. PCC 6803 to changing nitrogen availability. According to these results, 6S RNA supports a rapid acclimation to changing nitrogen supply by regulating the switch from group 2 σ factors SigB, SigC and SigE to SigA-dependent transcription.

Background Circadian clocks are found in organisms of almost all domains including photosynthetic Cyanobacteria, whereby large diversity exists within the protein components involved. In the model cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 circadian rhythms are driven by a unique KaiABC protein clock, which is embedded in a network of input and output factors. Homologous proteins to the KaiABC clock have been observed in Bacteria and Archaea, where evidence for circadian behavior in these domains is accumulating. However, interaction and function of non-cyanobacterial Kai-proteins as well as homologous input and output components remain mainly unclear. Results Using a universal BLAST analyses, we identified putative KaiC-based timing systems in organisms outside as well as variations within Cyanobacteria. A systematic analyses of publicly available microarray data elucidated interesting variations in circadian gene expression between different cyanobacterial strains, which might be correlated to the diversity of genome encoded clock components. Based on statistical analyses of co-occurrences of the clock components homologous to Synechococcus elongatus PCC 7942, we propose putative networks of reduced and fully functional clock systems. Further, we studied KaiC sequence conservation to determine functionally important regions of diverged KaiC homologs. Biochemical characterization of exemplary cyanobacterial KaiC proteins as well as homologs from two thermophilic Archaea demonstrated that kinase activity is always present. However, a KaiA-mediated phosphorylation is only detectable in KaiC1 orthologs. Conclusion Our analysis of 11,264 genomes clearly demonstrates that components of the Synechococcus elongatus PCC 7942 circadian clock are present in Bacteria and Archaea. However, all components are less abundant in other organisms than Cyanobacteria and KaiA, Pex, LdpA, and CdpA are only present in the latter. Thus, only reduced KaiBC-based or even simpler, solely KaiC-based timing systems might exist outside of the cyanobacterial phylum, which might be capable of driving diurnal oscillations.