Plant cells are immobile; thus, plant growth and development depend on cell expansion rather than cell migration. The molecular mechanism by which the plasma membrane initiates changes in the cell expansion rate remains elusive. We found that a secreted peptide, RALF (rapid alkalinization factor), suppresses cell elongation of the primary root by activating the cell surface receptor FERONIA in Arabidopsis thaliana. A direct peptide-receptor interaction is supported by specific binding of RALF to FERONIA and reduced binding and insensitivity to RALF-induced growth inhibition in feronia mutants. Phosphoproteome measurements demonstrate that the RALF-FERONIA interaction causes phosphorylation of plasma membrane H(+)-adenosine triphosphatase 2 at Ser(899), mediating the inhibition of proton transport. The results reveal a molecular mechanism for RALF-induced extracellular alkalinization and a signaling pathway that regulates cell expansion.

Abstract Centrioles are microtubule-based organelles required for the formation of centrosomes and cilia. Centriolar microtubules, unlike their cytosolic counterparts, grow very slowly and are very stable. The complex of centriolar proteins CP110 and CEP97 forms a cap that stabilizes the distal centriole end and prevents its over-elongation. Here, we used in vitro reconstitution assays to show that whereas CEP97 does not interact with microtubules directly, CP110 specifically binds microtubule plus ends, potently blocks their growth and induces microtubule pausing. Cryo-electron tomography indicated that CP110 binds to the luminal side of microtubule plus ends and reduces protofilament peeling. Furthermore, CP110 directly interacts with another centriole biogenesis factor, CPAP/SAS- 4, which tracks growing microtubule plus ends, slows down their growth and prevents catastrophes. CP110 and CPAP synergize in inhibiting plus-end growth, and this synergy depends on their direct binding. Together, our data reveal a molecular mechanism controlling centriolar microtubule plus- end dynamics and centriole biogenesis.

Abstract γ-tubulin ring complex (γ-TuRC) is the major microtubule-nucleating factor. After nucleation, microtubules can be released from γ-TuRC and stabilized by other proteins, such as CAMSAPs, but the biochemical cross-talk between minus-end regulation pathways is poorly understood. Here, we reconstituted this process in vitro using purified components. We found that all CAMSAP proteins could bind to the minus-ends of γ-TuRC-attached microtubules. CAMSAP2 and CAMSAP3, which decorate and stabilize growing minus ends, but not the minus-end tracking protein CAMSAP1 induced microtubule release from γ-TuRC. CDK5RAP2, a γ-TuRC-interactor, and CLASP2, a regulator of microtubule growth, stimulated γ-TuRC-dependent microtubule nucleation, but only CDK5RAP2 inhibited CAMSAP-driven microtubule detachment by suppressing CAMSAP binding to γ-TuRC-anchored minus ends. CDK5RAP2 also improved γ-TuRC selectivity for 13-rather than 14-protofilament microtubules in microtubule-capping assays. Our results support a model whereby CAMSAPs exploit an imperfect attachment between γ-TuRC and the nucleated microtubule to promote minus-end elongation and release, whereas CDK5RAP2 improves the fit between γ-TuRC and 13-protofilament microtubules and enhances nucleation.

Abstract Microtubules are dynamic cytoskeletal polymers, and their organization and stability are tightly regulated by numerous cellular factors. While regulatory proteins controlling formation of interphase microtubule arrays and mitotic spindles have been extensively studied, the biochemical mechanisms responsible for generating stable microtubule cores of centrioles and cilia are poorly understood. Here, we used in vitro reconstitution assays to investigate microtubule-stabilizing properties of CSPP1, a centrosome and cilia-associated protein mutated in the neurodevelopmental ciliopathy Joubert syndrome. We found that CSPP1 preferentially binds to polymerizing microtubule ends that grow slowly or undergo growth perturbations and, in this way, resembles microtubule-stabilizing compounds such as taxanes. Fluorescence microscopy and cryo-electron tomography showed that CSPP1 is deposited in the microtubule lumen and inhibits microtubule growth and shortening through two separate domains. CSPP1 also specifically recognizes and stabilizes damaged microtubule lattices. These data help to explain how CSPP1 regulates elongation and stability of ciliary axonemes and other microtubule-based structures.

Abstract Functional interactions between cytotoxic T cells and tumor cells are central to anti-cancer immunity. Some of the proteins involved, particularly immune checkpoints expressed by T cells, serve as promising clinical targets in immunotherapy. However, our understanding of the complexity and dynamics of the interactions between tumor cells and T cells is only rudimentary. Here we present HySic (for Hy brid quantification of S ILAC (Stable Isotope Labelling by Amino acids in Cell culture)-labeled interacting c ells) as an innovative method to quantify protein and phosphorylation dynamics between and within physically interacting (heterotypic) cells. We show that co-cultured HLA/antigen-matched tumor and T cells engage in physical and stable interactions, allowing for in-depth HySic analysis. This method does not require physical separation of the two cell types for subsequent MS proteome and phosphoproteome measurement using label free quantification (LFQ). We demonstrate that HySic can be used to unravel proteins contributing to functional T cell:tumor cell interactions. We validated HySic with established interactions, including those mediating IFNγ signaling. Using HySic we identified the RHO/RAC/PAK1 signaling pathway to be activated upon interaction of T cells and tumor cells. Pharmacologic inhibition of PAK1 sensitized tumor cells to T cell killing. Thus, HySic is an innovative and simple method to study short-term protein signaling dynamics in physically interacting cells, which can be easily extended to other biological systems.

Abstract Cilia are essential motile or sensory organelles found on many eukaryotic cells. Their formation and function rely on axonemal microtubules, which exhibit very slow dynamics, however the underlying biochemical mechanisms are largely unexplored. Here, we reconstituted in vitro the individual and collective activities of the ciliary tip module proteins, CEP104, CSPP1, TOGARAM1, ARMC9 and CCDC66, which interact with each other and with microtubules, and, when mutated, cause ciliopathies such as Joubert syndrome. CEP104, a protein containing a tubulin-binding TOG domain, is an inhibitor of microtubule growth and shortening that interacts with EBs on the microtubule surface and with a luminal microtubule-pausing factor CSPP1. Another TOG-domain protein, TOGARAM1, overcomes growth inhibition imposed by CEP104 and CSPP1. CCDC66 and ARMC9 do not affect microtubule dynamics directly but act as scaffolds for their partners. Cryo-electron tomography showed that together, ciliary tip module members form plus-end-specific cork-like structures which reduce protofilament flaring. The combined effect of these proteins is very slow processive microtubule elongation, which recapitulates axonemal dynamics in cells.