Coccidioides immitis, cause of a recent epidemic of "Valley fever" in California, is typical of many eukaryotic microbes in that mating and meiosis have yet to be reported, but it is not clear whether sex is truly absent or just cryptic. To find out, we have undertaken a population genetic study using PCR amplification, screening for single-strand conformation polymorphisms, and direct DNA sequencing to find molecular markers with nucleotide-level resolution. Both population genetic and phylogenetic analyses indicate that C. immitis is almost completely recombining. To our knowledge, this study is the first to find molecular evidence for recombination in a fungus for which no sexual stage has yet been described. These results motivate a directed search for mating and meiosis and illustrate the utility of single-strand conformation polymorphism and sequencing with arbitrary primer pairs in molecular population genetics.

A major cause of the paucity of new starting points for drug discovery is the lack of interaction between academia and industry. Much of the global resource in biology is present in universities, whereas the focus of medicinal chemistry is still largely within industry. Open source drug discovery, with sharing of information, is clearly a first step towards overcoming this gap. But the interface could especially be bridged through a scale-up of open sharing of physical compounds, which would accelerate the finding of new starting points for drug discovery. The Medicines for Malaria Venture Malaria Box is a collection of over 400 compounds representing families of structures identified in phenotypic screens of pharmaceutical and academic libraries against the Plasmodium falciparum malaria parasite. The set has now been distributed to almost 200 research groups globally in the last two years, with the only stipulation that information from the screens is deposited in the public domain. This paper reports for the first time on 236 screens that have been carried out against the Malaria Box and compares these results with 55 assays that were previously published, in a format that allows a meta-analysis of the combined dataset. The combined biochemical and cellular assays presented here suggest mechanisms of action for 135 (34%) of the compounds active in killing multiple life-cycle stages of the malaria parasite, including asexual blood, liver, gametocyte, gametes and insect ookinete stages. In addition, many compounds demonstrated activity against other pathogens, showing hits in assays with 16 protozoa, 7 helminths, 9 bacterial and mycobacterial species, the dengue fever mosquito vector, and the NCI60 human cancer cell line panel of 60 human tumor cell lines. Toxicological, pharmacokinetic and metabolic properties were collected on all the compounds, assisting in the selection of the most promising candidates for murine proof-of-concept experiments and medicinal chemistry programs. The data for all of these assays are presented and analyzed to show how outstanding leads for many indications can be selected. These results reveal the immense potential for translating the dispersed expertise in biological assays involving human pathogens into drug discovery starting points, by providing open access to new families of molecules, and emphasize how a small additional investment made to help acquire and distribute compounds, and sharing the data, can catalyze drug discovery for dozens of different indications. Another lesson is that when multiple screens from different groups are run on the same library, results can be integrated quickly to select the most valuable starting points for subsequent medicinal chemistry efforts.

Marine invertebrates representing at least five phyla are symbiotic with dinoflagellates from the genus Symbiodinium. This group of single-celled protists was once considered to be a single pandemic species, Symbiodinium microadriaticum. Molecular investigations over the past 25 years have revealed, however, that Symbiodinium is a diverse group of organisms with at least eight (A–H) divergent clades that in turn contain multiple molecular subclade types. The diversity within this genus may subsequently determine the response of corals to normal and stressful conditions, leading to the proposal that the symbiosis may impart unusually rapid adaptation to environmental change by the metazoan host. These questions have added importance due to the critical challenges that corals and the reefs they build face as a consequence of current rapid climate change. This review outlines our current understanding of the diverse genus Symbiodinium and explores the ability of this genus and its symbioses to adapt to rapid environmental change.

Cryptococcus gattii causes life-threatening disease in otherwise healthy hosts and to a lesser extent in immunocompromised hosts. The highest incidence for this disease is on Vancouver Island, Canada, where an outbreak is expanding into neighboring regions including mainland British Columbia and the United States. This outbreak is caused predominantly by C. gattii molecular type VGII, specifically VGIIa/major. In addition, a novel genotype, VGIIc, has emerged in Oregon and is now a major source of illness in the region. Through molecular epidemiology and population analysis of MLST and VNTR markers, we show that the VGIIc group is clonal and hypothesize it arose recently. The VGIIa/IIc outbreak lineages are sexually fertile and studies support ongoing recombination in the global VGII population. This illustrates two hallmarks of emerging outbreaks: high clonality and the emergence of novel genotypes via recombination. In macrophage and murine infections, the novel VGIIc genotype and VGIIa/major isolates from the United States are highly virulent compared to similar non-outbreak VGIIa/major-related isolates. Combined MLST-VNTR analysis distinguishes clonal expansion of the VGIIa/major outbreak genotype from related but distinguishable less-virulent genotypes isolated from other geographic regions. Our evidence documents emerging hypervirulent genotypes in the United States that may expand further and provides insight into the possible molecular and geographic origins of the outbreak.

The present work describes the application of homologous recombination techniques in a wild-type Aspergillus terreus (ATCC 20542) strain to increase the flow of precursors towards the lovastatin biosynthesis pathway. A new strain was generated to overexpress acetyl-CoA carboxylase (ACCase) by replacing the native ACCase promoter with a strong constitutive PadhA promoter from Aspergillus nidulans. Glycerol and a mixture of lactose and glycerol were used independently as the carbon feedstock to determine the degree of response by the A. terreus strains towards the production of acetyl-CoA, and malonyl-CoA. The new strain increased the levels of malonyl-CoA and acetyl-CoA by 240% and 14%, respectively, compared to the wild-type strain. As a result, lovastatin production was increased by 40% and (+)-geodin was decreased by 31% using the new strain. This study shows for the first time that the metabolism of Aspergillus terreus can be manipulated to attain higher levels of precursors and valuable secondary metabolites.

Abstract Plasma activated water (PAW) contains a cocktail of reactive oxidative species and free radicals and has demonstrated efficacy as a sanitizer for fresh produce, however there is a need for further optimization. The antimicrobial efficacy of PAW produced by a bubble spark discharge (BSD) reactor and a dielectric barrier discharge-diffuser (DBDD) reactor operating at atmospheric conditions with air, discharge frequencies of 500, 1000 and 1500 Hz, and MilliQ and tap water, was investigated with model organisms Listeria innocua and Escherichia coli . Optimal conditions were subsequently employed for pathogenic bacteria Listeria monocytogenes, E. coli and Salmonella enterica . PAW generated with the DBDD reactor reduced more than 6-log CFU of bacteria within 1 minute of treatment. The BSD-PAW, while attaining high CFU reduction was less effective, particularly for L. innocua . Analysis of physicochemical properties revealed BSD-PAW had a greater variety of reactive species than DBDD-PAW. Scavenger assays were employed to specifically sequester reactive species, including the short-lived superoxide (·O 2 - ) radical that could not be directly measured in the PAW. This demonstrated a critical role of superoxide for the inactivation of both E. coli and L. innocua by DBDD-PAW, while in BSD-PAW it had a role in L. innocua inactivation only. Overall, this study demonstrates the potential of DBDD-PAW in fresh produce, where there is a need for sterilization while minimizing chemical inputs and residues and maintaining food quality. Highly effective PAW was generated using air as a processing gas and tap water, making this a feasible and cost-effective option. Importance There is a growing demand for fresh food produced with minimal processing, however guaranteeing microbial safety in the absence of a thermal kill step is challenging. Plasma-activated water (PAW) is a promising novel antimicrobial but its use in high-risk applications like the sanitization of fresh produce requires further optimization. This study demonstrated the importance of reactor design in the production of reactive species in PAW with capacity to kill bacteria. Very effective PAW was generated using a dielectric barrier discharge-diffuser (DBDD) system, with antimicrobial activity attributed to the presence of superoxide radicals. The DBBD reactor used air as a processing gas and tap water, highlighting the potential of this approach as a cost-effective and green alternative to chemical treatment methods that are currently used in food decontamination.

Abstract Healing and treatment of chronic wounds are often complicated due to biofilm formation by pathogens. Here, the efficacy of Plasma Activated Water (PAW) as a pre-treatment strategy has been investigated prior to the application of topical antiseptics polyhexamethylene biguanide, povidone iodine, and MediHoney, which are routinely used to treat chronic wounds. The efficacy of this treatment strategy was determined against biofilms of Escherichia coli formed on a plastic substratum and on a human keratinocyte monolayer substratum used as an in vitro biofilm-skin epithelial cell model. PAW pre-treatment greatly increased the killing efficacy of all the three antiseptics to eradicate the E. coli biofilms formed on the plastic and keratinocyte substrates. However, the efficacy of the combined PAW-antiseptic treatment and single treatments using PAW or antiseptic alone was lower for biofilms formed in the in vitro biofilm-skin epithelial cell model compared to the plastic substratum. Scavenging assays demonstrated that reactive species present within the PAW were largely responsible for its anti-biofilm activity. PAW treatment resulted in significant intracellular RONS accumulation within the E. coli biofilms, while also rapidly acting on the microbial membrane leading to outer membrane permeabilisation and depolarisation. Together, these factors contribute to significant cell death, potentiating the antibacterial effect of the assessed antiseptics.

Abstract The effect of plasma activated water (PAW) generated with a dielectric barrier discharge diffusor (DBDD) system on microbial load and organoleptic quality of cucamelons was investigated and compared to the established sanitizer, sodium hypochlorite (NaOCl). Pathogenic serotypes of Escherichia coli , Salmonella enterica , and Listeria monocytogenes were inoculated onto the surface of cucamelons (6.5 log CFU g −1 ) and into the wash water (6 log CFU mL −1 ). PAW treatment involved 2 minutes in situ with water activated at 1500 Hz and 120 V, and air as the feed gas; NaOCl treatment was a wash with 100 ppm total chlorine; and the control treatment was a wash with tap water. PAW treatment produced a 3 log CFU g −1 reduction of pathogens on the cucamelon surface without negatively impacting quality or shelf life. NaOCl treatment reduced the pathogenic bacteria on the cucamelon surface by 3-4 log CFU g −1 , however, this treatment also reduced fruit shelf life and quality. Both systems reduced 6 log CFU ml −1 pathogens in the wash water to below detectable limits. The critical role of superoxide anion radical (·O 2 − ) in the antimicrobial power of DBDD-PAW was demonstrated through a scavenger assay, and chemistry modelling confirmed that ·O 2 − generation readily occurs in DBDD-PAW generated with the employed settings. Modelling of the physical forces produced during plasma treatment showed that bacteria likely experience strong local electric fields and polarization. We hypothesize that these physical effects synergise with reactive chemical species to produce the acute antimicrobial activity seen with the in situ PAW system. Importance Plasma activated water (PAW) is an emerging sanitizer in the fresh food industry, where food safety must be achieved without a thermal kill step. Here we demonstrate PAW generated in situ to be a competitive sanitizer technology, providing a significant reduction of pathogenic and spoilage micro-organisms while maintaining the quality and shelf life of the produce item. Our experimental results are supported by modelling of the plasma chemistry and applied physical forces, which show that the system can generate highly reactive superoxide radicals and strong electric fields that combine to produce potent antimicrobial power. In situ PAW has promise in industrial applications as it only requires low power (12 W), tap water and air. Moreover, it does not produce toxic by-products or hazardous effluent waste, making it a sustainable solution for fresh food safety.

Abstract Superficial infections of the skin, hair and nails by fungal dermatophytes are the most prevalent of human mycoses, and many infections are refractory to treatment. As current treatment options are limited, recent research has explored drug synergy with azoles for dermatophytoses. Bisphosphonates, which are approved to treat osteoporosis, can synergistically enhance the activity of azoles in diverse yeast pathogens but their activity has not been explored in dermatophytes or other molds. Market bisphosphonates risedronate, alendronate and zoledronate (ZOL) were evaluated for antifungal efficacy and synergy with three azole antifungals: fluconazole (FLC), itraconazole (ITR), and ketoconazole (KET). ZOL was the most active bisphosphonate tested, displaying moderate activity against nine dermatophyte species (MIC range 64–256 µg/mL), and was synergistic with KET in 88.9% of these species. ZOL was also able to synergistically improve the anti-biofilm activity of KET and combining KET and ZOL prevented the development of antifungal resistance. Rescue assays in Trichophyton rubrum revealed that the inhibitory effects of ZOL alone and in combination with KET were due to the inhibition of squalene synthesis. Fluorescence microscopy using membrane- and ROS-sensitive probes demonstrated that ZOL and KET:ZOL compromised membrane structure and induced oxidative stress. Antifungal activity and synergy between bisphosphonates and azoles were also observed in other clinically relevant molds, including species of Aspergillus and Mucor . These findings indicate that repurposing bisphosphonates as antifungals is a promising strategy for revitalising certain azoles as topical antifungals, and that this combination could be fast-tracked for investigation in clinical trials. Importance Fungal infections of the skin hair and nails, generally grouped together as “tineas” are the most prevalent infectious disease globally. These infections, caused by fungal species known as dermatophytes, are generally superficial, but can in some cases become aggressive. They are also notoriously difficult to resolve, with few effective treatments and rising levels of drug resistance. Here we report a potential new treatment that combines azole antifungals with bisphosphonates. Bisphosphonates are approved for the treatment of low bone density diseases, and in fungi they inhibit the biosynthesis of the cell membrane, which is also the target of azoles. Combinations were synergistic across the dermatophyte species and prevented the development of resistance. We extended the study to molds that cause invasive disease, finding synergy in some problematic species. We suggest bisphosphonates could be repurposed as synergents for tinea treatment, and that this combination could be fast-tracked for use in clinical therapy.