Single-molecule fluorescence techniques1,2,3 are key for a number of applications, including DNA sequencing4,5, molecular and cell biology6,7 and early diagnosis8. Unfortunately, observation of single molecules by diffraction-limited optics is restricted to detection volumes in the femtolitre range and requires pico- or nanomolar concentrations, far below the micromolar range where most biological reactions occur2. This limitation can be overcome using plasmonic nanostructures, which enable the confinement of light down to nanoscale volumes9,10,11,12,13. Although these nanoantennas enhance fluorescence brightness14,15,16,17,18,19,20, large background signals20,21,22 and/or unspecific binding to the metallic surface23,24,25 have hampered the detection of individual fluorescent molecules in solution at high concentrations. Here we introduce a novel ‘antenna-in-box’ platform that is based on a gap-antenna inside a nanoaperture. This design combines fluorescent signal enhancement and background screening, offering high single-molecule sensitivity (fluorescence enhancement up to 1,100-fold and microsecond transit times) at micromolar sample concentrations and zeptolitre-range detection volumes. The antenna-in-box device can be optimized for single-molecule fluorescence studies at physiologically relevant concentrations, as we demonstrate using various biomolecules. A plasmonic nanoantenna enables a thousand fold-enhanced fluorescence brightness allowing single-molecule analysis to be carried out in a zeptolitre volume at physiological concentrations.

Abstract Many viruses utilize the host endo-lysosomal network to infect cells. Tracing the endocytic itinerary of SARS-CoV2 can provide insights into viral trafficking and aid in designing new therapeutic targets. Here, we demonstrate that the receptor binding domain (RBD) of SARS-CoV2 is internalized via the clathrin and dynamin-independent, pH-dependent CLIC/GEEC (CG) endocytic pathway. Endosomal acidification inhibitors like BafilomycinA1 and NH 4 Cl, which inhibit the CG pathway, strongly block the uptake of RBD. Using transduction assays with SARS-CoV2 Spike-pseudovirus, we confirmed that these acidification inhibitors also impede viral infection. By contrast, Chloroquine neither affects RBD uptake nor extensively alters the endosomal pH, yet attenuates Spike-pseudovirus entry, indicating a pH-independent mechanism of intervention. We screened a subset of FDA-approved acidification inhibitors and found Niclosamide to be a potential SARS-CoV2 entry inhibitor. Niclosamide, thus, could provide broader applicability in subverting infection of similar category viruses entering host cells via this pH-dependent endocytic pathway.

Abstract Centrioles form centrosomes and cilia. In most proliferating cells, centrioles assemble through canonical duplication, which is spatially, temporally and numerically regulated by the cell cycle and the presence of mature centrioles. However, in certain cell-types, centrioles assemble de novo, yet by poorly understood mechanisms. Here, we established a controlled system to investigate de novo centriole biogenesis, using Drosophila melanogaster egg explants overexpressing Polo-like kinase 4 (Plk4), a trigger for centriole biogenesis. We show that at high Plk4 concentration, centrioles form de novo, mature and duplicate, independently of cell cycle progression and of the presence of other centrioles. Plk4 concentration determines the kinetics of centriole assembly. Moreover, our results suggest Plk4 operates in a switch-like manner to control the onset of de novo centriole formation, and that distinct biochemical kinetics regulate de novo and canonical biogenesis. Finally, we investigated which other factors modulate de novo centriole assembly and reveal that proteins of the pericentriolar matrix (PCM) promote biogenesis, likely by locally concentrating critical components.

Abstract Heating magnetic nanoparticles (MNPs) with AC (Alternating Current) magnetic fields has received significant attention in recent years, particularly for biomedical uses. However, most studies focus on characterizing the heat release, overlooking the fact that the MNPs in the viscous cell environment constitute a dynamic magnetic colloid whose configuration may evolve over time, particularly if a driving force as the AC field is applied. Aiming to shed light on this matter, in this workthe dynamics of the colloid structure during hyperthermia experiments are studied. By combining various experimental and theoretical tools, it is concluded that the AC field may drive the formation of aligned structures, and the impact that such structures may have on the associated heating is assessed. Remarkably, the results show that those field‐driven structures are highly unstable for small particle sizes, rapidly disassembling upon field removal. Moreover, an analogous behavior in vitro is found, with the AC magnetic field also promoting a reversible alignment of vesicles containing the MNPs within the cells. The results suggest that the observed alignment, both of MNPs and intracellular vesicles, may be a common phenomenon in usual hyperthermia experiments, but unnoticed because of the intrinsic unstable nature of the aligned structures.

ABSTRACT Stereocilia are apically located actin-protrusions found on the hair cells of the inner ear. At least three rows of stereocilia are arranged in a graded staircase pattern, which is vital for mechanosensation. Stereocilia form soon after the specification of hair cells. While these steps have been well-characterized in the avian auditory epithelium, the equivalent information in mice is lacking. Using scanning electron microscopy and super-resolution microscopy, we investigate stereocilia formation from hair cell specification stages in the mouse organ of Corti. Even before differentiation, we find that sensory progenitors, which will give rise to both hair cells and support cells, have a dense lawn of microvilli. Hair cell specialisation is first apparent as an enrichment in junctional actin, followed by the relocalisation of kinocilium into an eccentric position and the thickening of hair cell microvilli closest to the kinocilium. To determine actin signatures associated with hair cell development, we use a new analytical method to map cellular actin filament distribution during development. By nomalising relative actin filament density, we obtain insights into cuticular plate development and actin redistribution during the earliest phases of hair cell specialisation.

ABSTRACT The plasma membrane (PM) of cells is an asymmetric bilayer composed of a complex mixture of lipids and proteins. The emergent biophysical properties of its leaflets and their consequence on cellular function remain unexplored owing to the limitation in available probes. In this manuscript, we report on the design and characterisation of a PM-localised solvatochromic probe, C3L, based on the established reporter Laurdan. C3L is retained at the inner-leaflet due to flippase and scramblase activity, as determined by Bovine Serum Albumin-based back exchange experiments. By measuring the Generalized Polarization of C3L we are able to determine membrane order, leaflet-by-leaflet at the PM. Our results reveal that the PM is made of a tightly-packed outer/exofacial-leaflet in contrast to a disordered inner/cytoplasmic-leaflet. This differential packing is established by the maintenance of lipid asymmetry, the presence of specific lipids, Sphingomyelin in the outer-leaflet and Phosphatidylserine at the inner-leaflet, and exaggerated during mesenchymal to epithelial transition. We find spatial signatures of local modulation of the inner leaflet by protein scaffolds which promote trans-bilayer coupling of lipids. C3L thus informs on steady state lipid organisation at the asymmetric membrane while allowing further exploration of spatial regulation of lateral heterogeneity at each leaflet.

Abstract Quantitative fluorescence emission anisotropy microscopy reveals the organization of fluorescently labelled cellular components and allows for their characterization in terms of changes in either rotational diffusion or homo-Förster’s energy transfer characteristics in living cells. These properties provide insights into molecular organization, such as orientation, confinement and oligomerization in situ . Here we elucidate how quantitative measurements of anisotropy using multiple microscope systems may be made, by bringing out the main parameters that influence the quantification of fluorescence emission anisotropy. We focus on a variety of parameters that contribute to errors associated with the measurement of emission anisotropy in a microscope. These include the requirement for adequate photon counts for the necessary discrimination of anisotropy values, the influence of extinction coefficients of the illumination source, the detector system, the role of numerical aperture and excitation wavelength. All these parameters also affect the ability to capture the dynamic range of emission anisotropy necessary for quantifying its reduction due to homo-FRET and other processes. Finally, we provide easily implementable tests to assess whether homo-FRET is a cause for the observed emission depolarization.

GPI-anchored protein (GPI-AP) nanoclusters are generated by cortical acto-myosin activity. While our understanding of the physical principles behind this process is emerging, the molecular machinery required for the generation of these nanoclusters is unknown. Here, we show that ligand mediated membrane receptor signaling triggers nanocluster formation. Both soluble and surface-tethered RGD ligands bind the β1-integrin receptor and activate focal adhesion and src- kinases, resulting in RhoA signaling. This cascade ultimately triggers actin-nucleation via specific formins, driving nanoclustering of both GPI-APs and a model transmembrane protein with an actin-binding domain. Integrin signaling concurrently results in talin mediated activation of vinculin. This is necessary for the coupling of the dynamic actin machinery to the inner leaflet driving GPI-AP nanoclustering. Disruption of GPI-AP nanoclustering in either GPI-anchor remodeling mutants or in cells that express vinculin mutants, provide evidence that these nanoclusters are necessary for activating cell spreading, a hallmark of integrin function.