Abstract Bats stand out among mammalian species for their exceptional traits, including the capacity to navigate through flight and echolocation, conserve energy through torpor/hibernation, harbor a multitude of viruses, exhibit resistance to disease, survive harsh environmental conditions, and demonstrate exceptional longevity compared to other mammals of similar size. In vivo studies of bats can be challenging for several reasons such as ability to locate and capture them in their natural environments, limited accessibility, low sample size, environmental variation, long lifespans, slow reproductive rates, zoonotic disease risks, species protection, and ethical concerns. Thus, establishing alternative laboratory models is crucial for investigating the diverse physiological adaptations observed in bats. Obtaining quality cells from tissues is a critical first step for successful primary cell derivation. However, it is often impractical to collect fresh tissue and process the samples immediately for cell culture due to the resources required for isolating and expanding cells. As a result, frozen tissue is typically the starting resource for bat primary cell derivation. Yet, cells in frozen tissue are usually damaged and represent low integrity and viability. As a result, isolating primary cells from frozen tissues poses a significant challenge. Herein, we present a successfully developed protocol for isolating primary dermal fibroblasts from frozen bat wing biopsies. This protocol marks a significant milestone, as this the first protocol specially focused on fibroblasts isolation from bat frozen tissue. We also describe methods for primary cell characterization, genetic manipulation of primary cells through lentivirus transduction, and the development of stable cell lines. Basic Protocol 1: Bat wing biopsy collection and preservation Support Protocol 1: Blood collection from bat-venipuncture Basic Protocol 2: Isolation of primary fibroblasts from adult bat frozen wing biopsy Support Protocol 2: Maintenance of primary fibroblasts Support Protocol 3: Cell banking and thawing of primary fibroblasts Support Protocol 4: Growth curve and doubling time Support Protocol 5: Lentiviral transduction of bat primary fibroblasts Basic Protocol 3: Bat stable fibroblasts cell lines development Support Protocol 6: Bat fibroblasts validation by immunofluorescence staining Support Protocol 7: Chromosome counting

Abstract Cell lines have become an integral resource and tool for conducting biological experiments ever since the Hela cell line was first developed (1). They not only allow detailed investigation of molecular pathways but are faster and more cost-effective than most in vivo approaches. The last decade saw many emerging model systems strengthening basic science research. However, lack of genetic and molecular tools in these newer systems pose many obstacles. Astyanax mexicanus is proving to be an interesting new model system for understanding metabolic adaptation. To further enhance the utility of this system, we developed liver-derived cell lines from both surface-dwelling and cave-dwelling morphotypes. In this study, we provide detailed methodology of the derivation process along with a comprehensive biochemical and molecular characterization of the cell lines, which reflects key metabolic traits of cavefish adaptation. We anticipate these cell lines to become a useful resource for the Astyanax community as well as researchers investigating fish biology, comparative physiology, and metabolism.

Abstract Dysregulation of sleep has widespread health consequences and represents an enormous health burden. Short-sleeping individuals are predisposed to the effects of neurodegeneration, suggesting a critical role for sleep in the maintenance of neuronal health. While the effects of sleep on cellular function are not completely understood, growing evidence has identified an association between sleep loss and DNA damage, raising the possibility that sleep facilitates efficient DNA repair. The Mexican tetra fish, Astyanax mexicanus provides a model to investigate the evolutionary basis for changes in sleep and the consequences of sleep loss. Multiple cave-adapted populations of these fish have evolved to sleep for substantially less time compared to surface populations of the same species without identifiable impacts on healthspan or longevity. To investigate whether the evolved sleep loss is associated with DNA damage and cellular stress, we compared the DNA Damage Response (DDR) and oxidative stress levels between A. mexicanus populations. We measured markers of chronic sleep loss and discovered elevated levels of the DNA damage marker γH2AX in the brain, and increased oxidative stress in the gut of cavefish, consistent with chronic sleep deprivation. Notably, we found that acute UV-induced DNA damage elicited an increase in sleep in surface fish but not in cavefish. On a transcriptional level, only the surface fish activated the photoreactivation repair pathway following UV damage. These findings suggest a reduction of the DDR in cavefish compared to surface fish that coincides with elevated DNA damage in cavefish. To examine DDR pathways at a cellular level, we created an embryonic fibroblast cell line from the two populations of A. mexicanus . We observed that both the DDR and DNA repair were diminished in the cavefish cells, corroborating the in vivo findings and suggesting that the acute response to DNA damage is lost in cavefish. To investigate the long-term impact of these changes, we compared the transcriptome in the brain and gut of aged surface fish and cavefish. Strikingly, many genes that are differentially expressed between young and old surface fish do not transcriptionally vary by age in cavefish. Taken together, these findings suggest that have developed resilience to sleep loss, despite possessing cellular hallmarks of chronic sleep deprivation.

In vitro assays are crucial tools for gaining detailed insights into various biological processes, including metabolism. Cave morphs of the river-dwelling fish species, Astyanax mexicanus, have adapted their metabolism allowing them to thrive in the biodiversity-deprived and nutrient-limited environment of caves. Liver-derived cells from the cave and river morphs of Astyanax mexicanus have proven to be excellent in vitro resources to better understand the unique metabolism of these fish. However, the current 2D cultures have not fully captured the complex metabolic profile of the Astyanax liver. It is known that 3D culturing can modulate the transcriptomic state of cells when compared to its 2D monolayer culture. Therefore, in order to broaden the possibilities of the in vitro system by modeling a wider gamut of metabolic pathways, we cultured the liver-derived Astyanax cells of both surface and cavefish into 3D spheroids. We successfully established 3D cultures at various cell seeding densities for several weeks and characterized the resultant transcriptomic and metabolic variations. We found that the 3D cultured Astyanax cells represent a wider range of metabolic pathways, including cell cycle changes and antioxidant activities, associated with liver functioning as compared to its monolayer culture. Additionally, the spheroids also exhibited surface and cave-specific metabolic signatures, making it a suitable system for evolutionary studies associated with cave adaptation. Taken together, the liver-derived spheroids prove to be a promising in vitro model for widening our understanding of metabolism in Astyanax mexicanus and of vertebrates in general.