Article13 September 2011free access Dual role of FoxA1 in androgen receptor binding to chromatin, androgen signalling and prostate cancer Biswajyoti Sahu Biswajyoti Sahu Institute of Biomedicine, Physiology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Marko Laakso Marko Laakso Institute of Biomedicine, Physiology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Research Programs Unit, Genome-Scale Biology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Kristian Ovaska Kristian Ovaska Institute of Biomedicine, Physiology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Research Programs Unit, Genome-Scale Biology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Tuomas Mirtti Tuomas Mirtti Department of Pathology, Haartman Institute, University of Helsinki and HUSLAB, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland Institute for Molecular Medicine, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Johan Lundin Johan Lundin Institute for Molecular Medicine, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Antti Rannikko Antti Rannikko Department of Urology, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Anna Sankila Anna Sankila Department of Pathology, Haartman Institute, University of Helsinki and HUSLAB, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Juha-Pekka Turunen Juha-Pekka Turunen Department of Pathology, Haartman Institute, University of Helsinki and HUSLAB, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Mikael Lundin Mikael Lundin Institute for Molecular Medicine, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Juho Konsti Juho Konsti Institute for Molecular Medicine, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Tiina Vesterinen Tiina Vesterinen Institute for Molecular Medicine, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Stig Nordling Stig Nordling Department of Pathology, Haartman Institute, University of Helsinki and HUSLAB, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Olli Kallioniemi Olli Kallioniemi Institute for Molecular Medicine, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Sampsa Hautaniemi Sampsa Hautaniemi Institute of Biomedicine, Physiology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Research Programs Unit, Genome-Scale Biology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Olli A Jänne Corresponding Author Olli A Jänne Institute of Biomedicine, Physiology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Department of Clinical Chemistry, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Biswajyoti Sahu Biswajyoti Sahu Institute of Biomedicine, Physiology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Marko Laakso Marko Laakso Institute of Biomedicine, Physiology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Research Programs Unit, Genome-Scale Biology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Kristian Ovaska Kristian Ovaska Institute of Biomedicine, Physiology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Research Programs Unit, Genome-Scale Biology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Tuomas Mirtti Tuomas Mirtti Department of Pathology, Haartman Institute, University of Helsinki and HUSLAB, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland Institute for Molecular Medicine, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Johan Lundin Johan Lundin Institute for Molecular Medicine, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Antti Rannikko Antti Rannikko Department of Urology, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Anna Sankila Anna Sankila Department of Pathology, Haartman Institute, University of Helsinki and HUSLAB, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Juha-Pekka Turunen Juha-Pekka Turunen Department of Pathology, Haartman Institute, University of Helsinki and HUSLAB, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Mikael Lundin Mikael Lundin Institute for Molecular Medicine, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Juho Konsti Juho Konsti Institute for Molecular Medicine, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Tiina Vesterinen Tiina Vesterinen Institute for Molecular Medicine, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Stig Nordling Stig Nordling Department of Pathology, Haartman Institute, University of Helsinki and HUSLAB, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Olli Kallioniemi Olli Kallioniemi Institute for Molecular Medicine, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Sampsa Hautaniemi Sampsa Hautaniemi Institute of Biomedicine, Physiology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Research Programs Unit, Genome-Scale Biology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Olli A Jänne Corresponding Author Olli A Jänne Institute of Biomedicine, Physiology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland Department of Clinical Chemistry, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland Search for more papers by this author Author Information Biswajyoti Sahu1, Marko Laakso1,2, Kristian Ovaska1,2, Tuomas Mirtti3,4, Johan Lundin4, Antti Rannikko5, Anna Sankila3, Juha-Pekka Turunen3, Mikael Lundin4, Juho Konsti4, Tiina Vesterinen4, Stig Nordling3, Olli Kallioniemi4, Sampsa Hautaniemi1,2 and Olli A Jänne 1,6 1Institute of Biomedicine, Physiology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland 2Research Programs Unit, Genome-Scale Biology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, Helsinki, Finland 3Department of Pathology, Haartman Institute, University of Helsinki and HUSLAB, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland 4Institute for Molecular Medicine, University of Helsinki, Helsinki, Finland 5Department of Urology, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland 6Department of Clinical Chemistry, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland *Corresponding author. Institute of Biomedicine, Physiology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, PO Box 63, FI-00014 Helsinki, Finland. Tel.: +358 9 1912 5040; Fax: +358 9 1912 5047; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2011)30:3962-3976https://doi.org/10.1038/emboj.2011.328 PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info High androgen receptor (AR) level in primary tumour predicts increased prostate cancer-specific mortality. However, the mechanisms that regulate AR function in prostate cancer are poorly known. We report here a new paradigm for the forkhead protein FoxA1 action in androgen signalling. Besides pioneering the AR pathway, FoxA1 depletion elicited extensive redistribution of AR-binding sites (ARBs) on LNCaP-1F5 cell chromatin that was commensurate with changes in androgen-dependent gene expression signature. We identified three distinct classes of ARBs and androgen-responsive genes: (i) independent of FoxA1, (ii) pioneered by FoxA1 and (iii) masked by FoxA1 and functional upon FoxA1 depletion. FoxA1 depletion also reprogrammed AR binding in VCaP cells, and glucocorticoid receptor binding and glucocorticoid-dependent signalling in LNCaP-1F5 cells. Importantly, FoxA1 protein level in primary prostate tumour had significant association to disease outcome; high FoxA1 level was associated with poor prognosis, whereas low FoxA1 level, even in the presence of high AR expression, predicted good prognosis. The role of FoxA1 in androgen signalling and prostate cancer is distinctly different from that in oestrogen signalling and breast cancer. Introduction The androgen receptor (AR) mediates male sex steroid-dependent regulation of cell growth, differentiation and homeostasis (Heinlein and Chang, 2002). This receptor also plays an important role in both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer (Wang et al, 2009). In the nucleus, AR binds to cognate DNA response elements to mediate cell- and tissue-specific regulation of target gene expression (Heinlein and Chang, 2002; Heemers and Tindall, 2007). To form a productive transcription complex on chromatin and to bring about diverse biological actions of androgens, AR needs to communicate with coregulatory proteins (coactivators and corepressors) and collaborating transcription factors (Shang et al, 2002; Kang et al, 2004; Wang et al, 2005). Recent genome-wide studies have shown that nuclear receptors, such as oestrogen receptor (ER), glucocorticoid receptor (GR) and AR, bind to chromatin in vivo far away from transcription start sites of their target genes, which implies that distal enhancers are the primary receptor loading sites and suggests that the receptors utilize a distal regulatory mode of transcriptional control (Carroll et al, 2005; John et al, 2008; Lin et al, 2009; Cheung and Kraus, 2010). However, the underlying mechanisms that guide the receptors to their distal chromatin sites to ensure that regulation of only the intended genes occurs are still elusive. FoxA1/HNF-3α, a winged-helix transcription factor, is a member of the forkhead family, and it plays a critical role in the growth and differentiation of variety of organs, such as prostate, breast, lung and bladder (Lee et al, 2005; Friedman and Kaestner, 2006; Kaestner, 2010). In mouse prostate development, FoxA1 is required in both epithelial cell differentiation and ductal morphogenesis and patterning (Gao et al, 2005). FoxA1 has been reported to be involved in AR-mediated transcriptional regulation of prostate genes, such as rat probasin and human prostate-specific antigen (PSA) genes (Gao et al, 2003; Mirosevich et al, 2006). FoxA1-binding sites are found in close proximity of AR-binding sites (ARBs) in regulatory regions of these genes, and AR and FoxA1 have been reported to interact through their DNA-binding domains (Gao et al, 2003; Lee et al, 2008). FoxA proteins can behave as pioneer factors that engage chromatin before other transcription factors (Kaestner, 2010), and FoxA proteins are able to bind to nucleosomal DNA (Belikov et al, 2009; Sekiya et al, 2009). FoxA1 is a pioneer factor in the ERα-mediated transcriptional programme (Carroll et al, 2005; Eeckhoute et al, 2006; Lupien et al, 2008), and it also influences a subset of AR target genes (Gao et al, 2003; Lupien et al, 2008; Jia et al, 2009). On the other hand, FoxA1 is capable of creating a compact chromatin structure through recruitment of corepressor complexes, such as the Groucho family of proteins (Sekiya and Zaret, 2007), and a large proportion of FoxA1-binding sites are located outside the active chromatin regions (Eeckhoute et al, 2009). In this work, we have used LNCaP-1F5 cells, derivatives of LNCaP cells engineered to express the rat GR (Cleutjens et al, 1997) and chromatin immunoprecipitation (ChIP)-sequencing to delineate the genome-wide binding sites of AR and FoxA1—the AR and FoxA1 cistromes—in parental LNCaP-1F5 cells and in cells depleted of FoxA1 protein, in order to assess the role of FoxA1 in AR binding to chromatin and androgen-dependent transcription programme. To delineate the generality of these results, similar experiments on AR binding were conducted in VCaP cells, and on GR binding and glucocorticoid signalling in LNCaP-1F5 cells. Importantly, we also examined the predictive role that FoxA1 protein expression plays in prostate cancer progression, and our results show that, unlike in breast cancer (Badve et al, 2007; Albergaria et al, 2009), high FoxA1 protein level in primary prostate cancer specimens is associated with poor prognosis of the disease, whereas low FoxA1 level predicts good disease outcome, even in the presence of high AR expression. Results AR and FoxA1 cistromes in LNCaP-1F5 cells Genome-wide distribution of ARBs on LNCaP-1F5 cell chromatin was analysed by using ChIP-seq after a 2-h exposure to 100 nM 5α-dihydrotestosterone (DHT). The 2-h time point was selected on the basis of previous results on AR loading onto LNCaP cell chromatin (Kang et al, 2004; Wang et al, 2005; Thompson et al, 2006), showing that AR binding peaks by 2 h, and it stays relatively stable at least for the ensuing 12 h. Dose-response experiments indicated that 100 nM DHT was a saturating concentration and that a half-maximal AR loading onto chromatin was achieved by 1–3 nM DHT, as determined by using PSA and TMPRSS2 enhancers as the binding regions (Supplementary Figure S1). By using the MACS algorithm (Zhang et al, 2008), a total of 8419 high-confidence ARBs (false discovery rate (FDR) <2%) were found under these conditions (Sahu et al, in preparation). Motif over-representation analysis of the AR cistrome revealed that the FoxA1 motif was the most over-represented cis-element (ratio=2.62, P<10−244) (Figure 1A; Supplementary Table S1). This result together with the importance of FoxA1 in ERα signalling prompted us to assess genome-wide FoxA1-binding sites and their relation to the ARBs. FoxA1 ChIP-seq on LNCaP-1F5 chromatin identified initially 23 420 FoxA1-binding sites (FDR <2%). The peaks called from MACS were used to construct a transcription factor association strength (TFAS) for each gene (Ouyang et al, 2009). This analysis identified 6215 ARBs (Supplementary Table S2) and 18 281 FoxA1-binding sites (Supplementary Table S3) that were mapped to the nearest RefSeq gene on the basis of peak intensity and the proximity to the gene within a ±100-kb window. Comparison of AR and FoxA1 cistromes revealed that a high proportion of ARBs (∼71%) overlapped with FoxA1-binding sites (Figure 1B), with the median distance between the respective binding peaks being 43 nt (range, 0–653 nt; Supplementary Figure S2), suggesting a global role of FoxA1 in androgen signalling and providing credence to the pioneering role of FoxA1 in AR binding to chromatin (Wang et al, 2007; Lupien et al, 2008). With regard to the FoxA1 cistrome, however, only 24% of FoxA1-binding sites overlapped with ARBs. Examples of overlapping AR- and FoxA1-binding sites for some well-known AR target genes (KLK3, KLK2, DNM1L and TMPRSS2) are depicted in Supplementary Figure S3. Figure 1.AR and FoxA1 cistromes in LNCaP-1F5 cells and redistribution of the AR cistrome by FoxA1 depletion. (A) Consensus cis-element for FoxA1 was the most enriched DNA motif in the parental AR cistrome of LNCaP-1F5 cells. (B) Overlap between AR- and FoxA1-binding sites (FDR <2%) in LNCaP-1F5 cells. (C) Depletion of FoxA1 in LNCaP-1F5 cells treated for 72 h with siRNA specific for FoxA1 mRNA (siFoxA1) or control siRNA (parental). (D) Overlap of ARBs (FDR <2%) in parental (AR) and FoxA1-depleted (AR-siFoxA1) LNCaP-1F5 cells. (E) Class I ARBs are independent of FoxA1, despite potential colocalization of AR- and FoxA1-binding sites. The binding sites are shown for NKX3-1 and TMPRSS2 in parental and siFoxA1 cells. (F) Class II ARBs require FoxA1 as a pioneer factor. For LPAR3 and DNM1L, ARBs are present only in parental cells. (G) Class III ARBs involve FoxA1 as a repressor; AR binding occurs only in siFoxA1 cells. There are two ARB subtypes: (i) FoxA1 prevents AR recruitment to the same locus where FoxA1 is bound (EVL) and (ii) new ARBs appear at sites not previously occupied by FoxA1 (EDN2). Download figure Download PowerPoint Dual role of FoxA1 in AR binding to chromatin To examine the genome-wide role of FoxA1 in androgen signalling in more detail, we depleted FoxA1 in LNCaP-1F5 cells using FoxA1 mRNA-specific siRNA. FoxA1 mRNA and protein levels decreased by ∼80% upon the 72-h siRNA exposure (Figure 1C; Supplementary Figure S4A), at which time point the cells—treated with control or specific siRNAs—were exposed to 100 nM DHT for 2 h, followed by AR- and FoxA1-binding site identification with ChIP-seq. As expected on the basis of the data shown in Figure 1C, FoxA1 depletion did not result in a complete loss of FoxA1-binding sites; there were 4076 residual FoxA1 sites in the FoxA1-depleted cells (∼17% of that in parental cells) (Supplementary Table S4). Intriguingly, FoxA1 depletion resulted in a marked increase (over 2.5-fold) in the number of ARBs, and the AR cistrome in FoxA1-depleted cells comprises 17 022 ARBs (FDR <2%) as opposed to 6215 ARBs in parental cells (Figure 1D; Supplementary Table S5). Comparison of the AR cistromes in parental and FoxA1-depleted cells (siFoxA1 cells) indicated that 57% of the original ARBs (3517 sites) in parental cells were unchanged in the depleted cells, whereas 43% of the parental cell ARBs (2698 sites) were lost upon FoxA1 depletion. Importantly, 13 505 completely new ARBs were found in siFoxA1 cells, that is, more than twice that of parental cells (Figure 1D). Only a small proportion (<10%) of these new ARBs are found in data sets published thus far on ARBs in different prostate cancer cell lines. A number of ChIP-seq sites were validated by ChIP–qPCR for the three classes of ARBs (Supplementary Figure S5). The ChIP–qPCR data agreed very well with ChIP-seq results. Similar to LNCaP-1F5 cells, FoxA1 depletion resulted in a marked redistribution of ARBs in another prostate cancer cell line, the VCaP line, which contains a much higher number of ARBs than that in LNCaP-1F5 cells (Figure 2A and B). In VCaP cells, close to 32 000 new ARBs were found in siFoxA1 cells, and around 6000 ARBs were lost upon FoxA1 depletion. ChIP–qPCR validation for a number of FoxA1-independent and FoxA1-pioneered ARBs in VCaP cells is shown in Supplementary Figure S6. The ARBs in parental LNCaP-1F5 cells exhibited 87% overlap with those in parental VCaP cells. In siFoxA1 cells, the three ARB categories in LNCaP-1F5 cells overlapped with those in VCaP cells as follows: FoxA1-independent ARBs, 91%; FoxA1-pioneered ARBs, 10%; and FoxA1-depletion dependent new ARBs, 31%. The new ARBs in siFoxA1 VCaP cells validated in Figure 2C are also present in siFoxA1 LNCaP-1F5 cells. Figure 2.FoxA1 depletion in VCaP cells. (A) FoxA1 mRNA and protein levels. VCaP cells were treated for 72 h with siRNA specific for FoxA1 mRNA (siFoxA1) or control siRNA (parental). (B) Overlap of ARBs (FDR <2%) in parental and FoxA1-depleted VCaP cells. (C) Directed ChIP validation of new ARBs in parental (white bars) and FoxA1-depleted (solid bars) VCaP cells. The cells were exposed to 100 nM DHT (+) or vehicle (−) for 2 h prior to ChIP assays. Mean+s.e.m. values for duplicate samples are shown. Download figure Download PowerPoint FoxA1 defines three classes of ARBs and AR-regulated transcription programmes FoxA1 depletion results defined three distinct classes of ARBs: (i) the sites that are independent of FoxA1, and FoxA1 depletion does not perturb them (two examples are shown in Figure 1E), (ii) the sites that require FoxA1 as a pioneer factor to recruit AR onto chromatin and that disappear upon FoxA1 depletion (Figure 1F) and (iii) the sites that are masked by FoxA1 and become available for AR binding upon FoxA1 depletion (Figure 1G). This last, previously unrecognized class includes two subgroups; first, FoxA1 prevents AR binding to the same loci where FoxA1 is bound, and second, FoxA1 functions from distance, in that new ARBs appear in siFoxA1 cells at loci not previously occupied by FoxA1 in parental cells. These results indicate that ARBs in prostate cancer cells are remarkably fluid in nature and that their location is highly dependent on the presence (or concentration) of a DNA-binding transcription factor—FoxA1 in this case. Of note, all the above changes in the distribution of ARBs occurred without consistent changes in cellular AR protein content in LNCaP-1F5 or VCaP cells (Supplementary Figure S4B). To relate the localization of ARBs to androgen-specific transcription programmes, we profiled gene expression in parental and siFoxA1 cells before and after a 24-h exposure to 100 nM DHT and used a cutoff of ⩾1.7-fold change. Selection of the time interval (24 h) and the DHT concentration (100 nM) was based on the results shown in Supplementary Figure S7A–C. These results showed that maximal responses were achieved in each case at 24 h after exposure to 100 nM DHT. Of note, in the case of several FoxA1-independent genes (PSA and TMPRSS2 ARBs in Supplementary Figure S1, and PSA and NFKBIA mRNA levels in Supplementary Figure S7A), FoxA1 depletion resulted in increased sensitivity to lower DHT concentrations, and full FoxA1 independency was achieved only at higher androgen concentrations. The overall gene expression profiles were commensurate with the three classes of ARBs (cf., Figure 1), in that FoxA1 clearly defined three distinct AR-regulated transcription programmes, as studied in LNCaP-1F5 cells (Figure 3A). Only 45% of genes up-regulated and 42% of genes down-regulated by DHT in parental LNCaP-1F5 cells were androgen dependent in siFoxA1 cells, whereas 55% of the up-regulated and 58% of the down-regulated genes in parental cells lost their androgen dependency upon FoxA1 depletion. Importantly, FoxA1 depletion created new sets of androgen-dependent genes that were not regulated by DHT in parental cells. Similar to ARBs, the total number of androgen-responsive genes was significantly higher in siFoxA1 cells than parental cells. Figure 3.Dual role of FoxA1 in androgen-dependent transcription programme. (A) Venn diagram showing the numbers of androgen-regulated genes in parental and siFoxA1 cells. The cells were exposed to 100 nM DHT for 24 h, after which RNA was isolated for expression profiling by microarray using the cut-off of ⩾1.7-fold change. (B, C) Correlation between androgen-regulated (up- and down-regulated) and androgen-independent (stably expressed) genes and the incidence of binding sites unique to AR, shared by AR and FoxA1, and unique to FoxA1 within a window of ±100 kb of TSSs of the genes in parental cells (B) and in siFoxA1 cells (C). ***Significantly different (P<0.001) from stably expressed genes. (D) Unsupervised hierarchical clustering of androgen-regulated transcripts in parental and siFoxA1 cells before (Control) and after exposure to DHT. Heatmaps of biological duplicate samples are shown. (E) Violin plots (Hintze and Nelson, 1998) summarizing the changes in androgen-dependent transcripts in the three classes of genes defined by FoxA1. Download figure Download PowerPoint To address the functional significance of AR- and FoxA1-binding sites, occurring either together or alone, we examined their distribution in relation to androgen-regulated genes. To this end, we compared all androgen-dependent and androgen-independent (stably expressed) genes to binding sites unique to AR, shared by AR and FoxA1, and unique to FoxA1 within ±100 kb of the transcription start sites of the genes. AR and FoxA1 sites were significantly more enriched in parental cells among androgen-regulated genes (both up- and down-regulated) than among androgen-independent genes (Figure 3B). Importantly, the majority of androgen-regulated genes in these cells exhibited significant enrichment for binding sites shared by AR and FoxA1 over those unique to AR and, in each instance, the proportion of up-regulated genes exceeded that of down-regulated ones (Figure 3B). By contrast, in FoxA1-depleted cells, the majority of genes that were regulated by androgen exhibited enrichment of binding sites unique to AR, indicating that their regulation was independent of FoxA1 (Figure 3C). In siFoxA1 cells, a minor fraction of the genes was enriched for unique FoxA1 sites or for sites shared by AR and FoxA1, which is likely due to the fact that there were residual FoxA1 sites after siRNA exposure (see above). Thus, FoxA1 depletion relieves a marked repressive feature from chromatin that, in turn, permits emergence of new ARBs that are linked to expression of novel androgen-responsive genes. FoxA1 depletion altered the transcription programme already in the absence of androgen (Figure 3D), and similar transcript numbers were up-regulated (188) and down-regulated (198) by FoxA1 depletion. Likewise, the androgen-induced transcription programmes were significantly different between parental and siFoxA1 cells (Figure 3D). The differentially expressed genes upon androgen exposure segregated into three classes (Figure 3E). The expression levels of genes unique to parental cells lost their androgen regulation in siFoxA1 cells concomitantly with the loss of ARBs, whereas the genes whose ARBs were FoxA1-independent, maintained androgen responsiveness also in siFoxA1 cells. The new genes that were uniquely regulated in siFoxA1 cells by androgen upon the emergence of new ARBs in their regulatory regions were not regulated by DHT in parental cells. Even though FoxA1 depletion did not affect androgen-mediated regulation of FoxA1-independent genes, such as PSA, NFKBIA, SPDEF and NDRG1 (Supplementary Figure S8A), and the entire kallikrein cluster on chromosome 19 (Supplementary Figure S9), it influenced their basal expression levels; either up (PSA and NKFBIA) or down (SPDEF and NDRG1). It is currently not know whether these changes in basal expression relate to the changes in androgen sensitivity (see above). Nevertheless, the fold changes in response to androgen were not markedly different in parental and siFoxA1 cells. Basal expression levels of the genes that required FoxA1 pioneering were also altered, but importantly, their androgen regulation vanished upon FoxA1 depletion, as exemplified by LPAR3, LRIG1, EXTL2 and AFF3 genes (Supplementary Figure S8B). The genes that became androgen-regulated in FoxA1-depleted cells, such as ETS2, EDN2, FOXO1 and CITED1, exhibited changes in their basal expression levels, and showed robust androgen induction only in siFoxA1 cells (Supplementary Figure S8C). Pathway analysis using the WebGestalt (http://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/) pathway maps indicated that the three distinct AR-regulated transcription programmes in LNCaP-1F5 cells involved some shared, but to a great extent dissimilar biological processes. In particular, a large number of pathways regulated by DHT in siFoxA1 cells were not androgen-dependent among the pathways that were either independent of or pioneered by FoxA1 (Supplementary Table S6). Under FoxA1 depletion conditions, the new ARBs shared by LNCaP-1F5 and VCaP cells were linked to genes representing a number of new pathways or gene ontology categories related to hormonal signalling and cell proliferation (Supplementary Tables S7 and S8). Motif and cis-element analyses The DNA sequence in itself may act as an allosteric ligand for nuclear receptors, thereby affecting both receptor confirmation and regulatory activity (Meijsing et al, 2009). De novo motif search and motif over-representation analyses identified canonical ARE and FoxA1 motifs as the top-scoring cis-elements in the AR and FoxA1 cistromes of parental LNCaP-1F5 cells, respectively (Figure 4A and B). The ARBs independent of FoxA1 contained a top-scoring ARE very similar to that in parental cells (Figure 4C). Intriguingly, de novo motif search revealed a distinct top-scoring cis-element for the ARBs that were lost upon FoxA1 depletion (Figure 4D). This element may be considered as a tail-to-tail ARE spaced by four nucleotides, or alternatively, as compilation of an ARE half-site and a partial FoxA1 motif (cf., Figure 4A and B). De novo motif search for an extended 35 nt sequence supported the latter possibility (Figure 4G). Importantly, this unique sequence was highly over-represented among the ARBs pioneered by FoxA1 and corresponded 26% of all these sites, but was absent in the two other ARB categories (Supplementary Table S9). The median spacing between AR- and FoxA1-binding sites in the category of lost ARBs was 41 nt (range, 0–454 nt; Supplementary Figure S2). And finally, the new ARBs that appeared in siFoxA1 cells exhibited a canonical ARE as the top-scoring by de novo motif (Figure 4E); these sites were masked in parental cells in a FoxA1-dependent fashion and thus not accessible to AR binding in these cells. Figure 4.Top-scoring cis-elements by de novo motif search. (A) Top-scoring cis-element for the ARBs in parental cell AR cistrome. (B) Top-scoring cis-element for the FoxA1-binding sites in parental cell FoxA1 cistrome. (C) Top-scoring cis-element for the FoxA1-independent ARBs. (D) Top-scoring cis-element for ARBs that required FoxA1 pioneering. (E) Top-scoring cis-element for the new ARBs that appeared upon FoxA1 depletion. (F) CTCF as the over-repr

Abstract TMPRSS2-ERG and other gene fusions involving ETS factors and genes with strong promoter elements are common in prostate cancer. Although ERG activation has been linked to invasive properties of prostate cancers, the precise mechanisms and pathways of ERG-mediated oncogenesis remain poorly understood. Here, we show that ERG knockdown in VCaP prostate cancer cells causes an activation of cell adhesion, resulting in strongly induced active β1-integrin and E-cadherin expression as well as changes in WNT signaling. These observations were corroborated by data from ERG-overexpressing nontransformed prostate epithelial cells as well as gene expression data from clinical prostate cancer samples, which both indicated a link between ERG and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). Upregulation of several WNT pathway members was seen in ERG-positive prostate cancers, with frizzled-4 (FZD4) showing the strongest overexpression as verified by both reverse transcription-PCR and immunostaining. Both ERG knockin and knockdown modulated the levels of FZD4 expression. FZD4 silencing could mimic the ERG knockdown phenotype by inducing active β1-integrin and E-cadherin expression, whereas FZD4 overexpression reversed the phenotypic effects seen with ERG knockdown. Taken together, our results provide mechanistic insights to ERG oncogenesis in prostate cancer, involving activation of WNT signaling through FZD4, leading to cancer-promoting phenotypic effects, including EMT and loss of cell adhesion. Cancer Res; 70(17); 6735–45. ©2010 AACR.

Abstract Purpose Predictive biomarkers of immune checkpoint inhibitors (ICIs) efficacy are currently lacking for non-small cell lung cancer (NSCLC). Here, we describe the results from the Anti–PD-1 Response Prediction DREAM Challenge, a crowdsourced initiative that enabled the assessment of predictive models by using data from two randomized controlled clinical trials (RCTs) of ICIs in first-line metastatic NSCLC. Methods Participants developed and trained models using public resources. These were evaluated with data from the CheckMate 026 trial ( NCT02041533 ), according to the model-to-data paradigm to maintain patient confidentiality. The generalizability of the models with the best predictive performance was assessed using data from the CheckMate 227 trial ( NCT02477826 ). Both trials were phase III RCTs with a chemotherapy control arm, which supported the differentiation between predictive and prognostic models. Isolated model containers were evaluated using a bespoke strategy that considered the challenges of handling transcriptome data from clinical trials. Results A total of 59 teams participated, with 417 models submitted. Multiple predictive models, as opposed to a prognostic model, were generated for predicting overall survival, progression-free survival, and progressive disease status with ICIs. Variables within the models submitted by participants included tumor mutational burden (TMB), programmed death ligand 1 (PD-L1) expression, and gene-expression–based signatures. The bestperforming models showed improved predictive power over reference variables, including TMB or PD-L1. Conclusion This DREAM Challenge is the first successful attempt to use protected phase III clinical data for a crowdsourced effort towards generating predictive models for ICIs clinical outcomes and could serve as a blueprint for similar efforts in other tumor types and disease states, setting a benchmark for future studies aiming to identify biomarkers predictive of ICIs efficacy. Context summary Key objective Not all patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) eligible for immune checkpoint inhibitor (ICIs) respond to treatment, but accurate predictive biomarkers of ICIs clinical outcomes are currently lacking. This crowdsourced initiative enabled the robust assessment of predictive models using data from two randomized clinical trials of first-line ICI in metastatic NSCLC. Knowledge generated Models submitted indicate that a combination of programmed death ligand 1 (PD-L1), tumor mutational burden (TMB), and immune gene signatures might be able to identify patients more likely to respond to ICIs. TMB and PD-L1 seemed important to predict progression-free survival and overall survival. Mechanisms including apoptosis, T-cell crosstalk, and adaptive immune resistance appeared essential to predict response. Relevance

Abstract In many real-world applications, such as those based on patient electronic health records, prognostic prediction of patient survival is based on heterogeneous sets of clinical laboratory measurements. To address the trade-off between the predictive accuracy of a prognostic model and the costs related to its clinical implementation, we propose an optimized L 0 -pseudonorm approach to learn sparse solutions in multivariable regression. The model sparsity is maintained by restricting the number of nonzero coefficients in the model with a cardinality constraint, which makes the optimization problem NP-hard. In addition, we generalize the cardinality constraint for grouped feature selection, hence making it possible to identify key sets of predictors that may be measured together in a kit in clinical practice. We demonstrate the operation of our cardinality constraint-based feature subset selection method, named OSCAR, in the context of prognostic modelling of prostate cancer, where it enabled one to determine the key explanatory predictors at different levels of model sparsity, and to explore how the model sparsity affects the model accuracy and implementation cost. Author summary Feature selection has become a crucial part in building biomedical models, due to the abundance of available predictors in many applications, yet there remains an uncertainty of their importance and generalization ability. Regularized regression methods have become popular approaches to tackle this challenge by balancing the model goodness-of-fit against the increasing complexity of the model in terms of coefficients that deviate from zero. Regularization norms are pivotal in formulating the model complexity, and currently L 1 (LASSO), L 2 (Ridge Regression) and their hybrid (Elastic Net) norms dominate the field. In this paper, we present a novel methodology using the L 0 -pseudonorm, also known as the best subset selection, which has largely gone overlooked due to its challenging discrete nature. Our methodology makes use of a continuous transformation of the discrete optimization problem, and provides effective solvers implemented in a user friendly R software package. We exemplify the use of oscar-package in the context of prostate cancer prognostic prediction using both real-world hospital registry and clinical cohort data. By benchmarking the methodology against related regularization methods, we illustrate the advantages of the L 0 -pseudonorm for better clinical applicability and selection of grouped features.

Abstract Prostate cancer treatment resistance is a significant challenge facing the field. Genomic and transcriptomic profiling have partially elucidated the mechanisms through which cancer cells escape treatment, but their relation toward the tumor microenvironment (TME) remains elusive. Here we present a comprehensive transcriptomic landscape of the prostate TME at multiple points in the standard treatment timeline employing single-cell RNA-sequencing and spatial transcriptomics data from 110 patients. We identify club-like cells as a key epithelial cell subtype that acts as an interface between the prostate and the immune system. Tissue areas enriched with club-like cells have depleted androgen signaling and upregulated expression of luminal progenitor cell markers. Club-like cells display a senescence-associated secretory phenotype and their presence is linked to increased polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cell (PMN-MDSC) activity. Our results indicate that club-like cells partake in inducing myeloid inflammation previously associated with androgen deprivation therapy resistance, providing a rationale for their therapeutic targeting.

ABSTRACT Tumor-resident immune cells play a crucial role in eliciting anti-tumor immunity and immunomodulatory drug responses, yet these functions have been difficult to study without tractable models of tumor immune microenvironment (TIME). Patient-derived ex vivo models contain authentic resident immune cells and therefore, could provide new mechanistic insights into how TIME responds to tumor or immune cell-directed therapies. Here, we assessed the reproducibility and robustness of immunomodulatory drug responses across two different ex vivo models of breast cancer TIME and one of renal cell carcinoma. These independently developed TIME models were treated with a panel of clinically relevant immunomodulators, revealing remarkably similar changes in gene expression and cytokine profiles among the three models in response to T cell activation and STING-agonism while still preserving individual patient-specific response patterns. Moreover, we found two common core signatures of adaptive or innate immune responses present across all three models and both types of cancer, potentially serving as a benchmark for drug-induced immune activation in ex vivo models of TIME. The robust reproducibility of immunomodulatory drug responses observed across diverse ex vivo models of TIME underscores the significance of human patient-derived models in elucidating the complexities of antitumor immunity and therapeutic interventions.

Abstract Understanding the impact of radiotherapy on the evolution of treatment resistant prostate cancer is critical for selecting effective treatment combinations. Whilst activation of Type 1 interferon signalling is a hallmark of how cells respond to viral infection, in cancer cells, multiple stresses are known to activate this same response. In this study we have evaluated for the first time the changes in the interferon response induced by culturing prostate cancer cells under sphere- forming conditions and following irradiation. We report a conserved upregulated transcript profile for both conditions that is strongly associated with therapeutic resistance and cell survival in vitro and in vivo. The profile includes and is regulated by the Type 1 interferon master regulator IRF7 which, when depleted, delays tumour re-growth following irradiation. We immuno-stained two independent prostate cohorts for IRF7 and found that increased expression, particularly in cases with low PTEN expression, correlated with poor prognosis. To more comprehensively characterise the impact of IRF7 and radiation on cells, RNA-Seq was performed on IRF7 knockdown cells at different radiation doses. We identified a number of biological processes that were IRF7-dependent, including the formation of stem-like cell populations and also therapeutic vulnerabilities. For example, irradiation sensitised surviving cells to either a combination of an IKKε/TBK1 and a MEK inhibitor or treatment with an inhibitor of IDO1, an IRF7- dependent gene. Translationally our work suggests that IRF7 expression can be used to stratify patients who may not benefit from receiving radiotherapy alone but rather may benefit from treatment combinations. In two cohorts treated with radical intent, strong IRF7 staining was associated with disease-specific death implicating this pathway as a convergence point for therapeutic resistance in prostate and potentially other cancer types.

Abstract Defining the transition from benign to malignant tissue is fundamental to improve early diagnosis of cancer. Here, we provide an unsupervised approach to study spatial genome integrity in situ to gain molecular insight into clonal relationships. We employed spatially resolved transcriptomics to infer spatial copy number variations in >120 000 regions across multiple organs, in benign and malignant tissues. We demonstrate that genome-wide copy number variation reveals distinct clonal patterns within tumours and in nearby benign tissue. Our results suggest a model for how genomic instability arises in histologically benign tissue that may represent early events in cancer evolution. We highlight the power of an unsupervised approach to capture the molecular and spatial continuums in a tissue context and challenge the rationale for treatment paradigms, including focal therapy.

Abstract Prostate cancer treatment resistance is a significant challenge facing the field. Genomic and transcriptomic profiling have partially elucidated the mechanisms through which cancer cells escape treatment, but their relation toward the tumor microenvironment (TME) remains elusive. Here we present a comprehensive transcriptomic landscape of the prostate TME at multiple points in the standard treatment timeline employing single-cell RNA-sequencing and spatial transcriptomics data from 120 patients. We identify club-like cells as a key epithelial cell subtype that acts as an interface between the prostate and the immune system. Tissue areas enriched with club-like cells have depleted androgen signaling and upregulated expression of luminal progenitor cell markers. Club-like cells display a senescence-associated secretory phenotype and their presence is linked to increased polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cell (PMN-MDSC) activity. Our results indicate that club-like cells are associated with myeloid inflammation previously linked to androgen deprivation therapy resistance, providing a rationale for their therapeutic targeting.