The second messenger cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is the most important modulator of sympathetic control over cardiac contractility. In cardiac myocytes and many other cell types, however, cAMP transduces the signal generated upon stimulation of various receptors and activates different cellular functions, raising the issue of how specificity can be achieved. In the general field of signal transduction, the view is emerging that specificity is guaranteed by tight localization of signaling events. Here, we show that in neonatal rat cardiac myocytes, beta-adrenergic stimulation generates multiple microdomains with increased concentration of cAMP in correspondence with the region of the transverse tubule/junctional sarcoplasmic reticulum membrane. The restricted pools of cAMP show a range of action as small as approximately 1 micrometer, and free diffusion of the second messenger is limited by the activity of phosphodiesterases. Furthermore, we demonstrate that such gradients of cAMP specifically activate a subset of protein kinase A molecules anchored in proximity to the T tubule.

Epac1 is a guanine nucleotide exchange factor for Rap1 that is activated by direct binding of cAMP. In vitro studies suggest that cAMP relieves the interaction between the regulatory and catalytic domains of Epac. Here, we monitor Epac1 activation in vivo by using a CFP–Epac–YFP fusion construct. When expressed in mammalian cells, CFP–Epac–YFP shows significant fluorescence resonance energy transfer (FRET). FRET rapidly decreases in response to the cAMP‐raising agents, whereas it fully recovers after addition of cAMP‐lowering agonists. Thus, by undergoing a cAMP‐induced conformational change, CFP–Epac–YFP serves as a highly sensitive cAMP indicator in vivo . When compared with a protein kinase A (PKA)‐based sensor, Epac‐based cAMP probes show an extended dynamic range and a better signal‐to‐noise ratio; furthermore, as a single polypeptide, CFP–Epac–YFP does not suffer from the technical problems encountered with multisubunit PKA‐based sensors. These properties make Epac‐based FRET probes the preferred indicators for monitoring cAMP levels in vivo .

Cardiac myocytes have provided a key paradigm for the concept of the compartmentalized cAMP generation sensed by AKAP-anchored PKA. Phosphodiesterases (PDEs) provide the sole route for degrading cAMP in cells and are thus poised to regulate intracellular cAMP gradients. PDE3 and PDE4 represent the major cAMP degrading activities in rat ventriculocytes. By performing real-time imaging of cAMP in situ, we establish the hierarchy of these PDEs in controlling cAMP levels in basal conditions and on stimulation with a β-adrenergic receptor agonist. PDE4, rather than PDE3, appears to be responsible for modulating the amplitude and duration of the cAMP response to beta-agonists. PDE3 and PDE4 localize to distinct compartments and this may underpin their different functional roles. Our findings indicate the importance of distinctly localized PDE isoenzymes in determining compartmentalized cAMP signaling.

Inositol trisphosphate (IP3) is a major Ca2+-mobilising second messenger and atrial IP3 receptor (IP3R) expression is greatly increased in atrial fibrillation (AF). Cardiac atrial and sino-atrial node (SAN) myocytes also express Ca2+-stimulated adenylyl cyclases (AC1 and AC8); however the pathways underlying atrial AC1 and AC8 activation are unknown. We investigated whether IP3 signalling in cardiac atria and SAN utilises ACs. Immunocytochemistry in isolated guinea pig atrial myocytes identified co-localisation of type 2 IP3Rs with AC8, while AC1 was located in close vicinity. UV photorelease of IP3 significantly enhanced Ca2+ transient amplitudes following stimulation of atrial myocytes (31 ± 6 % increase 60 s post photorelease, n=16), an effect abolished by inhibitors of ACs (MDL-12,330) or PKA (H89). The maximum rate change observed in spontaneously-beating murine right atrial preparations exposed to phenylephrine (14.7 ± 0.5 %, n=10) was significantly reduced by 2.5 μmol/L 2-APB and abolished by a low dose of MDL-12,330. These observations are consistent with a functional interaction between IP3 and cAMP signalling involving Ca2+ stimulation of ACs in cardiac atria and the SAN. Structural evidence supports AC8 as the most likely effector. This signal transduction mechanism is important for future study in atrial physiology and pathophysiology, particularly AF.

Atrial fibrillation (AF) is the most common sustained cardiac arrhythmia. Excessive stimulation of the IP3 signaling pathway has been linked to AF through abnormal calcium handling. However, little is known about the mechanisms involved in this process. We expressed Fluorescence resonance energy transfer (FRET) based cytosolic cAMP sensor EPAC-SH187 in neonatal rat atrial myocytes (NRAMs) and neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs). In NRAMs, addition of the alpha-1 agonist phenylephrine (PE, 3 uM) resulted in a bi-phasic FRET change (R1) 21.20 +/- 7.43% and (R2) 9.67 +/- 4.23% and addition of membrane permeant IP3 derivative, 2,3,6-tri-O-Butyryl-myo-IP3(1,4,5)-hexakis(acetoxymethyl)ester (IP3-AM, 20 uM) resulted in a peak of 20.31 +/- 6.74%. These FRET changes imply an increase in cAMP. Prior application of IP3 receptor (IP3R) inhibitors 2-Aminoethyl diphenylborinate (2-APB, 2.5 uM) or Xestospongin-C (0.3 uM) significantly inhibited the change in FRET in NRAMs in response to PE. Xestospongin-C (0.3 uM) significantly inhibited the change in FRET in NRAMs in response to IP3-AM. The FRET change in response to PE in NRVMs were not inhibited by 2-APB or Xestospongin-C. Finally, the localisation of cAMP signals was tested by expressing the FRET-based cAMP sensor, AKAP79-CUTie, which targets the intracellular surface of the plasmalemma. We found in NRAMs that PE led to FRET change corresponding to an increase in cAMP that was inhibited by 2-APB and Xestospongin C. This data support further investigation of the pro-arrhythmic nature and components of IP3 induced cAMP signalling to identify potential pharmacological targets.

Abstract In the heart, endogenous nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) triggers lysosomal calcium release to augment sarcoplasmic reticulum (SR) calcium sequestration, producing larger calcium transients. However, the role of lysosomal calcium signals in pacemaker activity, a distinct calcium-operated function of the sino-atrial node (SAN) or atria, a distinct calcium-operated function, has not been investigated. Pharmacological or genetic ablation of the NAADP pathway inhibits spontaneous beating rate response to β-adrenergic stimulation in intact SAN. We found intracellular signalling microdomains between lysosomes and neighbouring SR or mitochondria in mouse, rabbit, goat, and human atrial tissue. The spatial relationship between lysosomes and other calcium-handling organelles are altered in goat and human atrial fibrillation. Furthermore, we demonstrate atrial myocytes produce 3′–5′-cyclic adenosine monophosphate in response to lysosomal signalling, adding a novel trigger for cyclic nucleotide signalling. Our findings support the hypothesis that lysosomal calcium signaling directly increases cardiomyocyte cAMP and modulates pacemaker activity.

Abstract Atrial arrhythmias, such as atrial fibrillation (AF), are a major mortality risk and a leading cause of stroke. The IP 3 signalling pathway has been proposed as an atrial specific target for AF therapy, and atrial IP 3 signalling has been linked to the activation of calcium sensitive adenylyl cyclases AC1 and AC8. Here we investigated the involvement of AC1 in the response of intact mouse atrial tissue and isolated guinea pig atrial and sinoatrial node (SAN) cells to the α-adrenoceptor agonist phenylephrine (PE) using the selective AC1 inhibitor ST034307. The maximum rate change of spontaneously beating mouse right atrial tissue exposed to PE was reduced from 14.46 % to 8.17% ( P = 0.005) in the presence of 1 μM ST034307, whereas the increase in tension generated in paced left atrial tissue in the presence of PE was not inhibited by ST034307 (Control = 14.20 %, ST034307 = 16.32 %; P > 0.05). Experiments were performed using isolated guinea pig atrial and SAN cells loaded with Fluo-5F-AM to record changes in calcium transient amplitude (CaT) generated by 10μM PE in the presence and absence of 1μM ST034307. ST034307 significantly reduced the beating rate of SAN cells (0.34-fold decrease; P = 0.004), but did not result in an inhibition of CaT amplitude increase in response to PE in atrial cells. The results presented here demonstrate the involvement of AC1 in the downstream response of atrial pacemaker activity to α-adrenoreceptor stimulation and IP 3 R calcium release.