The unique properties of agonist binding to the frog erythrocyte beta-adrenergic receptor include the existence of two affinity forms of the receptor. The proportion and relative affinity of these two states of the receptor for ligands varies with the intrinsic activity of the agonist and the presence of guanine nucleotides. The simplest model for hormone-receptor interactions which can explain and reproduce the experimental data involves the interaction of the receptor R with an additional membrane component X, leading to the agonist-promoted formation of a high affinity ternary complex HRX. Computer modeling of agonist binding data with a ternary complex model indicates that the model can fit the data with high accuracy under conditions where the ligand used is either a full or a partial agonist and where the system is altered by the addition of guanine nucleotide or after treatment with group-specific reagents, e.g. p-hydroxymercuribenzoate. The parameter estimates obtained indicate that the intrinsic activity of the agonist is correlated significantly with the affinity constant L of the component X for the binary complex HR. The major effect of adding guanine nucleotides is to destabilize the ternary complex HRX from which both the hormone H and the component X can dissociate. The modulatory role of nucleotides on the affinity of agonists for the receptor is consistent with the assumption that the component X is the guanine nucleotide binding site. The ternary complex model was also applied successfully to the turkey erythrocyte receptor system. The model provides a general scheme for the activation by agonists of adenylate cyclase-coupled receptor systems and also of other systems where the effector might be different.

Cellular responses to many hormones and neurotransmitters wane rapidly despite continuous exposure of cells to these stimuli. This phenomenon, termed desensitization, has been particularly well studied for the stimulation of cAMP levels by plasma membrane β-adrenergic receptors (βAR). The molecular mechanisms underlying rapid βAR desensitization do not appear to require internalization of the receptors, but rather an alteration in the functioning of βAR themselves that uncouples the receptors from the stimulatory G protein Gs. This uncoupling phenomenon involves phosphorylation of βAR by at least two kinases, PKA and the βAR kinase (βARK), which are activated under different desensitizing conditions. Receptor phosphorylation by the two kinases leads to desensitization of the receptor response via distinct biochemical mechanisms, and additional cytosolic factors appear to be involved in the case of βARK. Numerous experimental approaches have been used recently to elucidate the molecular details of this ubiquitous biological process.— Hausdorff, W. P.; Caron, M. G.; Lefkowitz, R. J. Turning off the signal: desensitization of β-adrenergic receptor function. FASEB J. 4: 2881-2889; 1990.

We have replaced the C-terminal portion of the third intracellular loop of the beta 2-adrenergic receptor (residues 266-272) with the homologous region of the alpha 1B-adrenergic receptor. In a fashion analogous to the reciprocal mutations of the alpha 1B receptor previously described (Cotecchia, S., Exum, S., Caron, M. G., and Lefkowitz, R. J. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 2896-2900), this conservative substitution leads to agonist-independent activation of adenylyl cyclase. In addition, the constitutively active mutant receptor exhibits: (i) an increased affinity for agonists (even in the absence of guanine nucleotide-binding regulatory protein (G protein)) but not antagonists, with the extent of affinity increase being correlated with the intrinsic activity of the ligand; (ii) an increased potency of agonists for stimulation of adenylyl cyclase; and (iii) an increased intrinsic activity of partial agonists. We document that our experimental findings with the mutant receptor cannot be adequately rationalized within the theoretical framework of the Ternary Complex Model (De Lean, A., Stadel, J. M., and Lefkowitz, R. J. (1980) J. Biol. Chem. 255, 7108-7117) which postulates that receptor activation requires the agonist-promoted formation of an active, ternary complex of agonist, receptor, and G protein. We show, through extensive computer simulations, that an extended version of this model that includes an explicit isomerization of the receptor (R) to an active state (R*) closely models all our findings for both the mutant and the wild-type receptors. Study of such constitutively active mutant G protein-coupled receptors should help elucidate the molecular nature of the processes involved in receptor activation.

Homologous or agonist-specific desensitization of beta-adrenergic receptors is thought to be mediated by a specific kinase, the beta-adrenergic receptor kinase (beta ARK). However, recent data suggest that a cofactor is required for this kinase to inhibit receptor function. The complementary DNA for such a cofactor was cloned and found to encode a 418-amino acid protein homologous to the retinal protein arrestin. The protein, termed beta-arrestin, was expressed and partially purified. It inhibited the signaling function of beta ARK-phosphorylated beta-adrenergic receptors by more than 75 percent, but not that of rhodopsin. It is proposed that beta-arrestin in concert with beta ARK effects homologous desensitization of beta-adrenergic receptors.

The ability of morphine to alleviate pain is mediated through a heterotrimeric guanine nucleotide binding protein (G protein)–coupled heptahelical receptor (GPCR), the μ opioid receptor (μOR). The efficiency of GPCR signaling is tightly regulated and ultimately limited by the coordinated phosphorylation of the receptors by specific GPCR kinases and the subsequent interaction of the phosphorylated receptors with β-arrestin 1 and β-arrestin 2. Functional deletion of the β-arrestin 2 gene in mice resulted in remarkable potentiation and prolongation of the analgesic effect of morphine, suggesting that μOR desensitization was impaired. These results provide evidence in vivo for the physiological importance of β-arrestin 2 in regulating the function of a specific GPCR, the μOR. Moreover, they suggest that inhibition of β-arrestin 2 function might lead to enhanced analgesic effectiveness of morphine and provide potential new avenues for the study and treatment of pain, narcotic tolerance, and dependence.

Dopamine plays an important role in the etiology of schizophrenia, and D2 class dopamine receptors are the best-established target of antipsychotic drugs. Here we show that D2 class-receptor-mediated Akt regulation involves the formation of signaling complexes containing β-arrestin 2, PP2A, and Akt. β-arrestin 2 deficiency in mice results in reduction of dopamine-dependent behaviors, loss of Akt regulation by dopamine in the striatum, and disruption of the dopamine-dependent interaction of Akt with its negative regulator, protein phosphatase 2A. Importantly, canonical cAMP-mediated dopamine-receptor signaling is not inhibited in the absence of β-arrestin 2. These results demonstrate that, apart from its classical function in receptor desensitization, β-arrestin 2 also acts as a signaling intermediate through a kinase/phosphatase scaffold. Furthermore, this function of β-arrestin 2 is important for the expression of dopamine-associated behaviors, thus implicating β-arrestin 2 as a positive mediator of dopaminergic synaptic transmission and a potential pharmacological target for dopamine-related psychiatric disorders.

Using both confocal immunofluorescence microscopy and biochemical approaches, we have examined the role of β-arrestins in the activation and targeting of extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2) following stimulation of angiotensin II type 1a receptors (AT1aR). In HEK-293 cells expressing hemagglutinin-tagged AT1aR, angiotensin stimulation triggered β-arrestin-2 binding to the receptor and internalization of AT1aR-β-arrestin complexes. Using red fluorescent protein-tagged ERK2 to track the subcellular distribution of ERK2, we found that angiotensin treatment caused the redistribution of activated ERK2 into endosomal vesicles that also contained AT1aR-β-arrestin complexes. This targeting of ERK2 reflects the formation of multiprotein complexes containing AT1aR, β-arrestin-2, and the component kinases of the ERK cascade, cRaf-1, MEK1, and ERK2. Myc-tagged cRaf-1, MEK1, and green fluorescent protein-tagged ERK2 coprecipitated with Flag-tagged β-arrestin-2 from transfected COS-7 cells. Coprecipitation of cRaf-1 with β-arrestin-2 was independent of MEK1 and ERK2, whereas the coprecipitation of MEK1 and ERK2 with β-arrestin-2 was significantly enhanced in the presence of overexpressed cRaf-1, suggesting that binding of cRaf-1 to β-arrestin facilitates the assembly of a cRaf-1, MEK1, ERK2 complex. The phosphorylation of ERK2 in β-arrestin complexes was markedly enhanced by coexpression of cRaf-1, and this effect is blocked by expression of a catalytically inactive dominant inhibitory mutant of MEK1. Stimulation with angiotensin increased the binding of both cRaf-1 and ERK2 to β-arrestin-2, and the association of β-arrestin-2, cRaf-1, and ERK2 with AT1aR. These data suggest that β-arrestins function both as scaffolds to enhance cRaf-1 and MEK-dependent activation of ERK2, and as targeting proteins that direct activated ERK to specific subcellular locations.