Abstract Neurodegeneration and chronic progressive neuroinflammation are well-documented in neurological lysosomal storage diseases, including Sanfilippo disease or mucopolysaccharidosis III (MPS III). Since chronic neuroinflammation has been linked to white matter tract pathology and defects in axonal transmission, we analysed axonal myelination and white matter density in the mouse model of MPS IIIC and human post-mortem brain samples from MPS IIIA, C, and D patients. Analyses of corpus callosum (CC) and spinal cord tissues by immunohistochemistry revealed substantially reduced levels of myelin-associated proteins including Myelin Basic Protein, Myelin Associated Glycoprotein, and Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. Furthermore, ultrastructural analyses revealed disruption of myelin sheath organization and reduced myelin thickness in the brains of MPS IIIC mice and human MPS IIIC patients compared to healthy controls. Oligodendrocytes (OLs) in the CC of MPS IIIC mice were scarce, while examination of the remaining cells revealed numerous enlarged lysosomes containing heparan sulfate, GM3 ganglioside or “zebra bodies” consistent with accumulation of lipids and myelin fragments. In addition, OLs contained swollen mitochondria with largely dissolved cristae, resembling those previously identified in the dysfunctional neurons of MPS IIIC mice. When brains of 7-month-old MPS IIIC mice were analysed by ex-vivo Diffusion Basis Spectrum Imaging to assess microarchitectural changes in the corpus callosum, we found compelling signs of demyelination (26% increase in radial diffusivity) and tissue loss (76% increase in hindered diffusivity). Our findings demonstrate an import role for white matter injury in the pathophysiology of MPS III. Moreover, this study reveals specific parameters and brain regions for MRI analysis, a crucial non-invasive method to evaluate disease progression and therapeutic response in neurological lysosomal storage diseases.

Abstract Recombinant human alpha- N -acetylglucosaminidase-insulin-like growth factor-2 (rhNAGLU-IGF2) is an investigational enzyme replacement therapy for Sanfilippo B, a lysosomal storage disease. Because recombinant human NAGLU (rhNAGLU) is poorly mannose 6-phosphorylated, we generated a fusion protein of NAGLU with IGF2 to permit its binding to the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. We previously administered rhNAGLU-IGF2 intracerebroventricularly to Sanfilippo B mice, and demonstrated therapeutic restoration of NAGLU, normalization of lysosomal storage, and improvement in markers of neurodegeneration and inflammation. Here, we studied repeated intracerebroventricular rhNAGLU-IGF2 delivery in both murine and canine Sanfilippo B to determine potential effects on their behavioral phenotypes and survival. Treated mice showed improvement in disease markers such as heparan sulfate glycosaminoglycans, beta-hexosaminidase, microglial activation, and lysosomal-associated membrane protein-1. Sanfilippo B mice treated with rhNAGLU-IGF2 displayed partial normalization of their stretch attend postures, a defined fear pose in mice (p<0.001). We found an improved rotarod performance in Sanfilippo B mice treated with rhNAGLU-IGF2 compared to vehicle-treated Sanfilippo B mice (p=0.002). We also found a 61% increase in survival in Sanfilippo B mice treated with rhNAGLU-IGF2 (mean 53w, median 48w) compared to vehicle-treated Sanfilippo B mice (mean 33w, median 37w; p<0.001). In canine Sanfilippo B, we found that rhNAGLU-IGF2 administered into cerebrospinal fluid normalized HS and beta-hexosaminidase activity in gray and white matter brain regions. Proteomic analysis of cerebral cortex showed restoration of protein expression levels in pathways relevant to cognitive, synaptic, and lysosomal functions. These data suggest that treatment with rhNAGLU-IGF2 may improve the phenotype of Sanfilippo B disease.

Abstract Cannabidiol (CBD) has gained attention as a therapeutic agent and is purported to have immunomodulatory, neuroprotective, and anti-seizure effects. Here, we determined the effects of chronic CBD administration in a mouse model of CLN1 disease ( Cln1 -/- ) that simultaneously exhibits neuroinflammation, neurodegeneration, and spontaneous seizures. Proteomic analysis showed that putative CBD receptors are expressed at similar levels in the brains of Cln1 -/- mice compared to normal animals. Cln1 -/- mice received an oral dose (100mg/kg/day) of CBD for six months and were evaluated for changes in pathological markers of disease and seizures. Chronic cannabidiol administration was well-tolerated, high levels of CBD were detected in the brain, and markers of astrocytosis and microgliosis were reduced. However, CBD had no apparent effect on seizure frequency or neuron survival. These data are consistent with CBD having immunomodulatory effects. It is possible that a higher dose of CBD could also reduce neurodegeneration and seizure frequency.

Abstract GABAergic interneuron deficits have been implicated in the epileptogenesis of multiple neurological diseases. While epileptic seizures are a key clinical hallmark of CLN2 disease, a childhood-onset neurodegenerative lysosomal storage disorder caused by a deficiency of tripeptidyl peptidase 1 (TPP1), the etiology of these seizures remains elusive. Given that Cln2 R207X/R207X mice display fatal spontaneous seizures and an early loss of several cortical interneuron populations, we hypothesized that those two events might be causally related. To address this hypothesis, we first generated an inducible transgenic mouse expressing lysosomal membrane-tethered TPP1 (TPP1LAMP1) on the Cln2 R207X/R207X genetic background to study the cell-autonomous effects of cell-type-specific TPP1 deficiency. We crossed the TPP1LAMP1 mice with Vgat-Cre mice to introduce interneuron-specific TPP1 deficiency. Vgat-Cre ; TPP1LAMP1 mice displayed storage material accumulation in several interneuron populations both in cortex and striatum, and increased susceptibility to die after PTZ-induced seizures. Secondly, to test the role of GABAergic interneuron activity in seizure progression, we selectively activated these cells in Cln2 R207X/R207X mice using Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADDs) in in Vgat-Cre : Cln2 R207X/R207X mice. EEG monitoring revealed that DREADD-mediated activation of interneurons via chronic deschloroclozapine administration accelerated the onset of spontaneous seizures and seizure-associated death in Vgat-Cre : Cln2 R207X/R207X mice, suggesting that modulating interneuron activity can exert influence over epileptiform abnormalities in CLN2 disease. Taken together, these results provide new mechanistic insights into the underlying etiology of seizures and premature death that characterize CLN2 disease.

Abstract Aims CLN2 disease is a fatal inherited childhood neurodegenerative disorder. Although a disease-modifying therapy now exists, a fundamental lack of understanding of disease pathogenesis has hampered development of more effective therapies. To better understand the cellular pathophysiology of CLN2 disease, we investigated the nature and progression of neuropathological and neurological changes in the recently generated Cln2 R207X mouse. Methods We have detailed microglial activation, astrogliosis, cytokine and chemokine expression, and neuron loss across the forebrain and spinal cords of Cln2 R207X mice, along with quantitative gait analysis. We also performed long-term electroencephalography (EEG) recordings to characterize seizure activity, a clinically-relevant phenotype yet to be defined in any CLN2 disease model. Results Histology revealed early localized microglial activation months before neuron loss in the thalamocortical system and spinal cord, which was accompanied by astrogliosis. These pathological changes were more pronounced and occurred in the cortex before the thalamus or spinal cord. There were early-onset and progressive changes in the expression of specific chemokines and cytokines including IL-33, IP-10, and MIP-1α. Gait analysis revealed impaired performance only at disease end stage. EEG recordings revealed robust and progressive epileptiform activity from disease mid-stage including spontaneous seizures, which were accompanied by a profound loss of cortical GABAergic interneurons. Conclusions Our data reveal novel phenotypes in Cln2 R207X mice that differ markedly in their timing and progression through the CNS from other NCL mouse models. Our findings provide new insights on CLN2 disease pathogenesis and clinically-relevant readouts for future therapeutic studies.

ABSTRACT Sanfilippo syndrome type B (Mucopolysaccharidosis type IIIB or MPS IIIB) is a recessive genetic disorder that severely affects the brain due to a deficiency in the enzyme α- N -acetylglucosaminidase (NAGLU), leading to intralysosomal accumulation of partially degraded heparan sulfate. There are no effective treatments for this disorder. In this project, we carried out an ex vivo lentiviral correction of neural stem cells derived from Naglu -/- mice (iNSCs) using a modified enzyme in which the NAGLU is fused to an Insulin-like Growth Factor II receptor (IGFIIR) binding peptide in order to improve the cross-correction efficiency. After brain transplantation of these corrected iNSCs into Naglu -/- mice and long-term evaluation of the cross-correction, we successfully detected NAGLU-IGFII activity in all transplanted animals, as well as decreased lysosomal accumulation and reduced astrocytic and microglial activation throughout the transplanted brain. In addition, we identified a novel neuropathological phenotype in untreated brains characterized by decreased levels of MAP2 protein and accumulation of synaptophysin-positive aggregates in the brain. Following transplantation, this Naglu -/- -specific phenotype was altered with restored levels of MAP2 expression and significantly reduced formation of synaptophysin-positive aggregates. Our results demonstrate the feasibility and long-term benefit of genetically corrected iNSCs transplantation in the Sanfilippo B brain and effective cross-correction of Sanfilippo-associated pathology in Naglu -/- mice. Our findings suggest that genetically engineered iNSCs can be used to effectively deliver the missing enzyme to the brain and treat Sanfilippo type B-associated neuropathology.

Abstract Background and aims Children with neurodegenerative disease often have debilitating gastrointestinal (GI) symptoms that may be due at least in part to underappreciated involvement of neurons in the enteric nervous system (ENS), the master regulator of bowel function. Methods We investigated bowel motility in mouse models of CLN1 and CLN2 disease, neurodegenerative lysosomal storage disorders caused by deficiencies in palmitoyl protein thioesterase-1 (PPT1) and tripeptidyl peptidase-1 (TPP1), respectively. We then explored the integrity of ENS anatomy in immunostained bowel wholemount preparations from these mice. Lastly, we administered adeno-associated viral gene therapy to neonatal mice and determined if this would prevent these newly identified bowel phenotypes. Results Mouse models of CLN1 and CLN2 disease both displayed slow bowel transit in vivo that worsened with age. Although the ENS appeared to develop normally, there was a progressive and profound loss of myenteric plexus neurons accompanied by changes in enteric glia in adult mice. Neonatal administration of adeno-associated virus-mediated gene therapy prevented bowel transit defects and the loss of many ENS neurons. Conclusions We show that two neurodegenerative lysosomal storage diseases cause profound and progressive damage to the mouse enteric nervous system and impair bowel motility. We also provide proof-of-principle evidence that gene therapy can prevent enteric nervous system disease. This study may have general therapeutic implications for many inherited neurodegenerative disorders. What you need to know Background and Context Many pediatric central nervous system disorders also have debilitating gastrointestinal symptoms. For most of these diseases, it is not known if the enteric nervous system (ENS) is also affected and to what degree ENS defects contribute to GI symptoms. To date, no attempts have been made to directly treat or prevent enteric nervous system disease via gene therapy. New Findings The enteric nervous system is severely affected in mouse models of CLN1 and CLN2 disease, profoundly neurodegenerative lysosomal storage disorders. Bowel transit defects and most of the enteric nervous system pathology can be prevented by neonatal administration of gene therapy. Limitations Information about enteric nervous system disease in human children is still lacking, and methods will need to be developed to treat the human bowel. Impact These findings identify an underappreciated effect of neurodegenerative disease upon the bowel and demonstrate that enteric nervous system degeneration can be prevented in mice. This provides a new perspective on these childhood disorders that may be applicable to many other conditions that affect the bowel. Lay Summary In children’s diseases where the brain degenerates, nerve cells in the bowel also die causing gastrointestinal problems, but this can be prevented by gene therapy.