Abstract Current hypotheses suggest that speech segmentation – the initial division and grouping of the speech stream into candidate phrases, syllables, and phonemes for further linguistic processing – is executed by a hierarchy of oscillators in auditory cortex. Theta (~3-12 Hz) rhythms play a key role by phase-locking to recurring acoustic features marking syllable boundaries. Reliable synchronization to quasi-rhythmic inputs, whose variable frequency can dip below cortical theta frequencies (down to ~1 Hz), requires “flexible” theta oscillators whose underlying neuronal mechanisms remain unknown. Using biophysical computational models, we found that the flexibility of phase-locking in neural oscillators depended on the types of hyperpolarizing currents that paced them. Simulated cortical theta oscillators flexibly phase-locked to slow inputs when these inputs caused both (i) spiking and (ii) the subsequent buildup of outward current sufficient to delay further spiking until the next input. The greatest flexibility in phase-locking arose from a synergistic interaction between intrinsic currents that was not replicated by synaptic currents at similar timescales. Flexibility in phase-locking enabled improved entrainment to speech input, optimal at mid-vocalic channels, which in turn supported syllabic-timescale segmentation through identification of vocalic nuclei. Our results suggest that synaptic and intrinsic inhibition contribute to frequency-restricted and -flexible phase-locking in neural oscillators, respectively. Their differential deployment may enable neural oscillators to play diverse roles, from reliable internal clocking to adaptive segmentation of quasi-regular sensory inputs like speech. Author summary Oscillatory activity in auditory cortex is believed to play an important role in auditory and speech processing. One suggested function of these rhythms is to divide the speech stream into candidate phonemes, syllables, words, and phrases, to be matched with learned linguistic templates. This requires brain rhythms to flexibly synchronize with regular acoustic features of the speech stream. How neuronal circuits implement this task remains unknown. In this study, we explored the contribution of inhibitory currents to flexible phase-locking in neuronal theta oscillators, believed to perform initial syllabic segmentation. We found that a combination of specific intrinsic inhibitory currents at multiple timescales, present in a large class of cortical neurons, enabled exceptionally flexible phase-locking, which could be used to precisely segment speech by identifying vowels at mid-syllable. This suggests that the cells exhibiting these currents are a key component in the brain’s auditory and speech processing architecture.

Abstract Background Finding conservative T cell epitopes in the proteome of numerous variants of SARS-COV-2 is required to develop T cell activating SARS-COV-2 capable of inducing T cell responses against SARS-COV-2 variants. Methods A computational workflow was performed to find HLA restricted CD8 + and CD4 + T cell epitopes among conserved amino acid sequences across the proteome of 474727 SARS-CoV-2 strains. Results A batch of covserved regions in the amino acid sequences were found in the proteome of the SARS-COV-2 strains. 2852 and 847 peptides were predicted to have high binding affinity to distint HLA class I and class II molecules. Among them, 1456 and 484 peptides are antigenic. 392 and 111 of the antigenic peptides were found in the conseved amino acid sequences. Among the antigenic-conserved peptides, 6 CD8 + T cell epitopes and 7 CD4 + T cell epitopes were identifed. The T cell epitopes could be presented to T cells by high-affinity HLA molecules which are encoded by the HLA alleles with high population coverage. Conclusions The T cell epitopes are conservative, antigenic and HLA presentable, and could be constructed into SARS-COV-2 vaccines for inducing protective T cell immunity against SARS-COV-2 and their variants.

SUMMARY A high-resolution protein atlas is essential for understanding the molecular basis of biological processes. Using protein-fusion reporters and imaging-based single-cell analyses, we present a protein expression atlas of C. elegans embryogenesis encompassing 266 transcription factors (TFs) in nearly all (90%) lineage-resolved cells. Single-cell analysis reveals a combinatorial code and cascade that elucidate the regulatory hierarchy between a large number of lineage-, tissue-, and time-specific TFs in spatiotemporal fate patterning. Guided by expression, we identify essential functions of CEH-43/DLX, a lineage-specific TF, and ELT-1/GATA3, a well-known skin fate specifier, in neuronal specification; and M03D4.4 as a pan-muscle TF in converging muscle differentiation in the body wall and pharynx. Finally, systems-level analysis of TF regulatory state uncovers lineage- and time-specific kinetics of fate progression and widespread detours of the trajectories of cell differentiation. Collectively, our work reveals a single-cell molecular atlas and general principles underlying the spatiotemporal patterning of a metazoan embryo.

Abstract Recent improvements in genetically encoded voltage indicators enabled optical imaging of action potentials and subthreshold membrane voltage dynamics from single neurons in the mammalian brain. To perform high speed voltage imaging, widefield microscopy remains an essential tool for recording activity from many neurons simultaneously over a large anatomical area. However, the lack of optical sectioning makes widefield microscopy more prone to background signal contamination, and thus far voltage imaging using fully genetically encoded voltage indicators remains limited to simultaneous sampling of a few cells over a restricted field-of-view. We here demonstrate a strategy for large scale voltage imaging using the fully genetically encoded voltage indicator SomArchon and targeted illumination. We implemented a simple, low-cost digital micromirror device based targeted illumination strategy to restrict illumination to the cells of interest, and systematically quantified the improvement of this microscopy design theoretically and experimentally with SomArchon expressing neurons in single layer cell cultures and in the brains of awake mice. We found that targeted illumination, in comparison to widefield illumination, increased SomArchon signal contrast and reduced background cross-contamination in the brain. Such improvement permitted the reduction of illumination intensity, and thus reduced fluorescence photobleaching and prolonged imaging duration. When coupled with a high-speed, large area sCMOS camera, we routinely imaged tens of spiking neurons simultaneously over minutes in the brain. Thus, the widefield microscopy design with an integrated targeted illumination system described here offers a simple solution for voltage imaging analysis of large neuron populations in behaving animals.

Abstract Solid-state NMR has emerged as a potent technique in structural biology, suitable for the study of fibrillar, micro-crystalline, and membrane proteins. Recent developments in fast-magic-angle-spinning and proton-detected methods have enabled detailed insights into structure and dynamics, but molecular-weight limitations for the asymmetric part of target proteins have remained at ~30-40 kDa. Here we employ solid-state NMR for atom-specific characterization of the 72 kDa (asymmetric unit) microcrystalline protein tryptophan synthase, an important target in pharmacology and biotechnology, chemical-shift assignments of which we obtain via higher-dimensionality, 4D and 5D solid-state NMR experiments. The assignments for the first time provide comprehensive data for assessment of side chain chemical properties involved in the catalytic turnover, and, in conjunction with first-principles calculations, precise determination of thermodynamic and kinetic parameters is demonstrated for the essential acid-base catalytic residue βK87. The insights provided by this study expand by nearly a factor of two the size limitations widely accepted for NMR today, demonstrating the applicability of solid-state NMR to systems that have been thought to be out of reach due to their complexity.

Abstract Caspase-8, a pivotal protease intricately involved in various cellular signaling pathways related to cell death and inflammation, has been identified as a contributor to cytokine production during septic shock. However, the mechanisms governing this regulatory role remain enigmatic. In this study, we uncovered that mice harboring a specific mutation in CYLD at its D215 position ( Cyld D 215 A/D 215 A mutant mice), rendering CYLD resistant to caspase8 cleavage, exhibited marked protection against lethal endotoxic shock. Moreover, the removal of Cyld in Caspase8 -/- Mlkl -/- mice restored their sensitivity to endotoxic shock, indicating Caspase8 promotes LPS-induced endotoxic shock by cleaving its substrate CYLD and maintaining CYLD stability confers resistance to endotoxic shock. Mechanistically, CYLD was found to catalyze the removal of LUBAC-mediated M1-linked ubiquitination of NF-kB p65 at K301/K303, thereby suppressing the nuclear translocation and activation of p65 for subsequent cytokines production. Notably, the cleaved N-terminal fragment of CYLD (named CP25) is secreted in a TRIF/Caspase8-dependent manner. Moreover, CP25 can be detected in the serum of septic mice, and its levels show a strong correlation with corresponding serum IL-1β, suggesting its potential utility as an inflammatory biomarker. Overall, these findings highlight the significance of CYLD cleavage as a promising therapeutic target and diagnostic marker for endotoxic shock.

Abstract Elucidating the expression of microRNAs in developing single cells is critical for functional discovery. Here, we construct scCAMERA (single-cell cartography of microRNA expression based on reporter assay), utilizing promoter-driven fluorescent reporters in conjunction with imaging and lineage tracing. The cartography delineates the transcriptional activity of 54 conserved microRNAs in lineage-resolved single cells throughout C. elegans embryogenesis. The combinatorial expression of microRNAs partitions cells into fine clusters reflecting their function and anatomy. Notably, the expression of individual microRNAs exhibits high cell specificity and divergence among family members. Guided by cellular expression patterns, we identify developmental functions of specific microRNAs, including miR-1 in pharynx development and physiology, miR-232 in excretory canal morphogenesis by repressing NHR-25/NR5A, and a functional synergy between miR-232 and miR-234 in canal development, demonstrating the broad utility of scCAMERA. Furthermore, integrative analysis reveals that tissue-specific fate determinants activate microRNAs to repress protein production from leaky transcripts associated with alternative, especially neuronal, fates, thereby enhancing the fidelity of developmental fate differentiation. Collectively, our study offers rich opportunities for multidimensional expression-informed analysis of microRNA biology in metazoans.

Although the classical biological protein cell cycle protein kinase CDK2 has been extensively studied in higher vertebrates, its function in lower vertebrates beyond the regulation of mitosis remains unknown. In this study, we report a distinct mechanism whereby IFN expression is negatively regulated in fish by CDK2. After infection with the spring viremia of carp virus (SVCV), fish CDK2 expression significantly increased in tissues and cells. Moreover, antiviral resistance was improved in cdk2 -/- homozygotes, and the antiviral cytokine interferon (IFN) expression was significantly higher. At the cellular level, CDK2 overexpression reduced IFN expression, while cdk2 knockdown increased the ability of cells to produce IFN. Subsequently, it was discovered that fish CDK2 binds and degrades TBK1, resulting in reduced IFN. CDK2 increases the K48-linked ubiquitination of TBK1, causing its degradation, while E3 ubiquitin ligase Dtx4 was found to be involved in this process following the significant enhancement of TBK1 K48-linked ubiquitination. Protein mass spectrometry and immunoblot analysis confirmed that the K567 site on TBK1 is essential for CDK2 to engage with Dtx4 and degrade TBK1; thus, after mutating the K567 site, K48-linked ubiquitination of TBK1 was not enhanced by Dtx4, and TBK1 was not degraded by CDK2. Our data demonstrate that fish CDK2 recruits the E3 ubiquitin ligase Dtx4 to target the K567 site of TBK1 and promote its degradation. These results suggest that CDK2 in lower vertebrates is implicated in a specialized role for antiviral innate immunity.

ABSTRACT Dietary trans 10, cis 12-conjugated linoleic acid (t10c12-CLA) is a potential candidate in anti-obesity trials. A transgenic mouse was previously successfully established to determine the anti-obesity properties of t10c12-CLA in male mice that could produce endogenous t10c12-CLA. To test whether there is a different impact of t10c12-CLA on lipid metabolism in both sexes, this study investigated the adiposity and metabolic profiles of female Pai mice that exhibited a dose-dependent expression of foreign Pai gene and a shift of t10c12-CLA content in tested tissues. Compared to their gender-match wild-type littermates, Pai mice had no fat reduction but exhibited enhanced lipolysis and thermogenesis by phosphorylated hormone-sensitive lipase and up-regulating uncoupling proteins in brown adipose tissue. Simultaneously, Pai mice showed hepatic steatosis and hypertriglyceridemia by decreasing gene expression involved in lipid and glucose metabolism. Further investigations revealed that t10c10-CLA induced excessive prostaglandin E2, adrenaline, corticosterone, glucagon and inflammatory factors in a dose-dependent manner, resulting in less heat release and oxygen consumption in Pai mice. Moreover, fibroblast growth factor 21 overproduction only in monoallelic Pai/wt mice indicates that it was sensitive to low doses of t10c12-CLA. These results suggest that chronic t10c12-CLA has system-wide effects on female health via synergistic actions of various hormones.

Abstract Electroacupuncture at Governor Vessel (GV), as a traditional chinese medicine, has been proved that it can reduce scar and promote axon regeneration. However, the underlying mechanism remains unclear. Herein, complexin1 (CPLX1), as a candidate protein, was found using protein chip. Therefore, using a CRISPR/Cas9 knockout approach, we deleted CPLX1 specifically in the SD rats to assess the role of CPLX1 in GV treatment. Additionally, eIF5A1 stimulate the translation of CPLX1 with PPG sequence, we attempt to uncover whether eIF5A1 play a role in the GV treatment. In fact, GV can reduce scar and promote axon regeneration after SCC. CPLX1 −/+ SCC rats demonstrated that decreased CPLX1 improved the microenvironment of injured area via reducing the components of fibrotic scar and further enhanced the synaptic plasticity, which benefit the regeneration of axons. And eIF5A1 could regulate the expression of CPLX1 in the process of GV treatment. Therefore, GV contributes to axon regeneration and synapse plasticity via eIF5A1 regulating CPLX1 following SCC, providing a convincible mechanism for improving the therapeutic efficacy of GV for SCC.