Abstract CRISPR-Cas9 editing is now the leading method for genome editing and is being advanced for the treatment of human disease. CRIPSR editing could have many applications for treatment of neurological diseases, including pain but traditional viral vector delivery approaches have neurotoxicity limiting their use. Overcoming these issues could open the door for genome editing treatments for diseases like intractable pain where the dorsal root ganglia (DRG) would be the desired target. To this end, we describe a simple method for viral-vector-independent transfection of primary human DRG (hDRG) neurons for CRISPR-Cas9 editing. As proof of principle, we edited TRPV1, NTSR2 , and CACNA1E using a lipofection method with CRISPR-Cas9 plasmids containing reporter tags (GFP or mCherry). Transfection was successful as demonstrated by the expression of the reporters as early as two days in vitro . CRISPR-Cas9 editing was confirmed at the genome level with insertion and deletion detection system T7-endonuclease-I assay; protein level with immunocytochemistry and Western blot; and functional level through capsaicin-induced Ca 2+ accumulation in a high-throughput compatible fluorescent imaging plate reader (FLIPR) system. This work establishes a reliable, target specific, non-viral CRISPR-Cas9-mediated genetic editing in primary human neurons with potential for future clinical application for intractable pain. Teaser We describe a non-viral transfection method for CRISPR-Cas9 gene editing in human dorsal root ganglion neurons.

Diabetic neuropathy is frequently accompanied by pain and loss of sensation attributed to axonal dieback. We recovered dorsal root ganglia (DRGs) from 90 organ donors, 19 of whom had medical indices for diabetic painful neuropathy (DPN). Nageotte nodules, dead sensory neurons engulfed by non-neuronal cells, were abundant in DPN DRGs and accounted for 25% of all neurons. Peripherin-and Nav1.7-positive dystrophic axons invaded Nageotte nodules, forming small neuroma-like structures. Using histology and spatial sequencing, we demonstrate that Nageotte nodules are mainly composed of satellite glia and non-myelinating Schwann cells that express SPP1 and are intertwined with sprouting sensory axons originating from neighboring neurons. Our findings solve a 100-year mystery of the nature of Nageotte nodules linking these pathological structures to pain and sensory loss in DPN.

Abstract Na V 1.7, a membrane-bound voltage-gated sodium channel, is preferentially expressed along primary sensory neurons, including their peripheral & central nerve endings, axons, and soma within the dorsal root ganglia and plays an integral role in amplifying membrane depolarization and pain neurotransmission. Loss- and gain-of-function mutations in the gene encoding Na V 1.7, SCN9A , are associated with a complete loss of pain sensation or exacerbated pain in humans, respectively. As an enticing pain target supported by human genetic validation, many compounds have been developed to inhibit Na V 1.7 but have disappointed in clinical trials. The underlying reasons are still unclear, but recent reports suggest that inhibiting Na V 1.7 in central terminals of nociceptor afferents is critical for achieving pain relief by pharmacological inhibition of Na V 1.7. We report for the first time that Na V 1.7 mRNA is expressed in putative projection neurons (NK1R+) in the human spinal dorsal horn, predominantly in lamina 1 and 2, as well as in deep dorsal horn neurons and motor neurons in the ventral horn. Na V 1.7 protein was found in the central axons of sensory neurons terminating in lamina 1-2, but also was detected in the axon initial segment of resident spinal dorsal horn neurons and in axons entering the anterior commissure. Given that projection neurons are critical for conveying nociceptive information from the dorsal horn to the brain, these data support that dorsal horn Na V 1.7 expression may play an unappreciated role in pain phenotypes observed in humans with genetic SCN9A mutations, and in achieving analgesic efficacy in clinical trials.