Thrombin has been implicated in the stimulation of smooth muscle cell (SMC) proliferation that contributes to post angioplasty restenosis. The present studies demonstrated that human alpha-thrombin was a potent and efficacious mitogen for cultured rat aortic SMC, stimulating an increase in 3H-thymidine incorporation, as well as an increase in cell number at 1 to 10 nM concentration. gamma-Thrombin, which is enzymatically active but lacks fibrinogen clotting activity, stimulated SMC mitogenesis but was approximately 10-fold less potent than alpha-thrombin. In contrast, D-phenylalanyl-L-propyl-L-arginyl-chloromethyl ketone-alpha-thrombin, which lacked enzymatic activity, had no mitogenic effect. Diisopropylfluorophosphate-alpha-thrombin failed to stimulate mitogenesis except at concentrations having equivalent enzymatic activity as that of alpha-thrombin at its threshold for mitogenesis. Thus, thrombin-induced proliferation was dependent on enzymatic activity. A 14-residue peptide (SFLLRNPNDKYEPF) corresponding to amino acids 42 through 55 of the human thrombin receptor (Vu, T. K., D. T. Hung, V. I. Wheaton, and S. R. Coughlin, 1991. Cell. 64:1057-1068) had full efficacy in stimulating SMC proliferation. Reversing the first two amino acids of this peptide abolished mitogenic activity. Northern analysis demonstrated that SMC expressed a single mRNA species that hybridized to a labeled thrombin receptor cDNA probe. These findings indicate that alpha-thrombin stimulates SMC proliferation via the proteolytic activation of a receptor very similar or identical to that previously identified.

Background: Rupture and erosion of advanced atherosclerotic lesions with a resultant myocardial infarction or stroke are the leading worldwide cause of death. However, we have a limited understanding of the identity, origin, and function of many cells that make up late-stage atherosclerotic lesions, as well as the mechanisms by which they control plaque stability. Methods: We conducted a comprehensive single-cell RNA sequencing of advanced human carotid endarterectomy samples and compared these with single-cell RNA sequencing from murine microdissected advanced atherosclerotic lesions with smooth muscle cell (SMC) and endothelial lineage tracing to survey all plaque cell types and rigorously determine their origin. We further used chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq), bulk RNA sequencing, and an innovative dual lineage tracing mouse to understand the mechanism by which SMC phenotypic transitions affect lesion pathogenesis. Results: We provide evidence that SMC-specific Klf4- versus Oct4-knockout showed virtually opposite genomic signatures, and their putative target genes play an important role regulating SMC phenotypic changes. Single-cell RNA sequencing revealed remarkable similarity of transcriptomic clusters between mouse and human lesions and extensive plasticity of SMC- and endothelial cell-derived cells including 7 distinct clusters, most negative for traditional markers. In particular, SMC contributed to a Myh11 - , Lgals3 + population with a chondrocyte-like gene signature that was markedly reduced with SMC- Klf4 knockout. We observed that SMCs that activate Lgals3 compose up to two thirds of all SMC in lesions. However, initial activation of Lgals3 in these cells does not represent conversion to a terminally differentiated state, but rather represents transition of these cells to a unique stem cell marker gene–positive, extracellular matrix-remodeling, “pioneer” cell phenotype that is the first to invest within lesions and subsequently gives rise to at least 3 other SMC phenotypes within advanced lesions, including Klf4-dependent osteogenic phenotypes likely to contribute to plaque calcification and plaque destabilization. Conclusions: Taken together, these results provide evidence that SMC-derived cells within advanced mouse and human atherosclerotic lesions exhibit far greater phenotypic plasticity than generally believed, with Klf4 regulating transition to multiple phenotypes including Lgals3 + osteogenic cells likely to be detrimental for late-stage atherosclerosis plaque pathogenesis.

Abstract Cryopreserved peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are frequently collected and provide disease- and treatment-relevant data in clinical studies. Here, we developed combined protein (40 antibodies) and transcript single cell (sc)RNA sequencing in PBMCs. Among 31 participants in the WIHS Study, we sequenced 41,611 cells. Using Boolean gating followed by Seurat UMAPs and Louvain clustering, we identified 58 subsets among CD4 T, CD8 T, B, NK cells and monocytes. This resolution was superior to flow cytometry, mass cytometry or scRNA-sequencing without antibodies. Since the transcriptome was not needed for cell identification, combined protein and transcript scRNA-Seq allowed for the assessment of disease-related changes in transcriptomes and cell type proportion. As a proof-of-concept, we showed such differences between healthy and matched individuals living with HIV with and without cardiovascular disease. In conclusion, combined protein and transcript scRNA sequencing is a suitable and powerful method for clinical investigations using PBMCs.

ABSTRACT Background Despite the decades-old knowledge that diabetes mellitus (DM) is a major risk factor for cardiovascular disease (CVD), the reasons for this association are only partially understood. Among the immune cells involved in CVD development, accumulating evidence supports the critical role of T cells as drivers and modifiers of this condition. CD4+ T cells are commonly found in atherosclerotic plaques. The activity and distribution of CD4+ T cell subsets differs between the sexes. Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of 61 men and women who underwent cardiac catheterization were interrogated by single cell RNA sequencing (scRNA-Seq, ∼200,000 cells) combined with 49 protein markers (CITE-Seq). Coronary artery disease (CAD) was quantified using Gensini scores, with scores above 30 considered CAD+ and below 6 considered CAD-. Four pairs of groups were matched for clinical and demographic parameters. To test how DM changed cell proportions and gene expression, we compared matched groups of diabetic and non-diabetic subjects. We analyzed 41,782 single CD4+ T cell transcriptomes for sex differences in 61 mostly statin-treated coronary artery disease patients with and without DM. Results We identified 16 clusters in CD4 T cells. The proportion of cells in CD4 cluster 8 (CD4T8, CCR2+ Em) was significantly decreased in CAD+, especially among DM+ participants. The proportions of cells in CD4T2, CD4T11, CD4T16 were increased and CD4T13 was decreased in CAD+ among DM+Statin+ participants. CD4T12 was increased in DM+ participants. In female participants, CD4T8, 12, and 13 were decreased compared to in male participants. In CD4 T cells, 31 genes showed significant and coordinated upregulation in both CAD and DM. The DM gene signature was partially additive to the CAD gene signature. Conclusions We conclude that CAD and DM are clearly reflected in PBMC transcriptomes and that significant differences exist between women and men and between subjects treated with statins or not.

Background: Fibrinogen-to-albumin ratio (FAR) has been proposed as a readily available inflammatory biomarker associated with coronary artery disease (CAD). However, its association with CAD severity and prognosis has predominantly been assessed in patients with acute coronary syndromes (ACS). The Leiden score is a validated comprehensive measure of CAD incorporating stenosis proximity, severity, and plaque type that independently predicts cardiovascular events. Whether FAR is associated with Leiden score or high-risk plaque features on coronary computed tomographic angiography (CCTA) in stable outpatients is unknown. Methods: Adult outpatients undergoing clinically indicated CCTA were enrolled (5/2021-9/2023) in a prospective study assessing the relationship of plaque to immune markers and provided same-day pre-scan peripheral venous blood samples. CCTAs were post-processed and analyzed by the consensus of two expert readers blinded to clinical data using a 17-segment model to determine coronary artery calcium (CAC), Leiden score, and high-risk plaque features. Patients were grouped by FAR (quartiles), Leiden score (<5, 5-20, >20), and CAC score (0, >0-100, >100-300, >300-1000, >1000). Numerical variables were compared via Wilcoxon and Kruskal-Willis tests. Spearman correlation was calculated between FAR and Leiden score. Results: Of 284 patients, 53.8% were male, 86.7% were white, and 58.8% were on a statin (Table 1). Median FAR was 70.3 mg/g, 64.0% had a non-zero CAC score, and 25.0% had at least one segment with one high-risk plaque feature. Across quartiles of FAR, there was no difference in Leiden score (5.8 (IQR: 0.0-18.5), 12.4 (3.1-20.7), 8.0 (0.0-19.9), 6.8 (0.0-21.1), p=0.50) or probability of having at least one segment with at least one (29.6%, 23.9%, 23.9%, 22.5%, p=0.69) or two (18.3%, 14.1%, 12.7%, 15.5%, p=0.66) high-risk plaque features. There was no correlation between FAR and Leiden score (R=0.03, p=0.66). There was no difference in FAR when stratified by Leiden score (Table 1, p=0.53), CAC score (Table 2, p=0.50), or number of segments with at least one high-risk plaque feature (Table 3, p=0.18). Conclusion: In a prospective cohort of adult outpatients across a wide spectrum of CAD burden with high rates of baseline statin use, FAR was not associated with CAD or presence of high-risk plaque features on CCTA. Further evaluation of its role as an inflammatory biomarker in larger populations, particularly patients without ACS, is required.

Introduction: B cells infiltrate the heart in a CXC chemokine receptor type 5 (CXCR5)-dependent manner and influence inflammation and remodeling. Yet whether CXCR5 expression on circulating B cells can be used as a marker to identify patients more likely to respond to pacing therapies for heart failure (HF) like cardiac resynchronization therapy (CRT) is unknown Research Question: Is the amount of CXCR5 expression on circulating B cells in humans prior to CRT associated with measures of left ventricular (LV) functional and neurohormonal response to CRT? Hypothesis: We hypothesized that lower B cell expression of CXCR5 pre-CRT is associated with greater improvements in LV function and neurohormonal activation (B-type natriuretic peptide [BNP]) after CRT. Methods: Protein expression in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was measured with cytometry by time of flight (CyTOF). CXCR5 expression in B cell subsets was evaluated before and six months after CRT in 24 patients. Cardiac magnetic resonance (CMR) was performed prior to CRT, and the LV end-systolic volume index (LVESVI) before and after CRT was assessed by echocardiography. Response was defined as a 15% reduction in the LVESVI six months after CRT. Results: In 24 patients with HF undergoing CRT, the median age was 68 years (IQR 61 to 75 years), 38% were female, and 15 were responders (R). The median pre-CRT serum BNP concentration was 178 pg/mL (IQR 94-251 pg/mL) in R and 430 (IQR 272-757 pg/mL) in non-responders (NR) (p=0.07). The median pre-CRT LVESVI was 74 mL/m 2 (IQR 60 to 103 mL/m 2 ) in R and 90 mL/m 2 (IQR 83 to 110 mL/m 2 ) in NR (p=0.19). Pre-CRT CXCR5 expression in naive B cells (CD27- IgDhiCD196lo IgMlo) was lower in R v. NR (p=0.0016) (Figure 1). The area under the receiver operating characteristic curve (AUROC) for response was 0.80 (p=0.0026) with B cell CXCR5 as the only predictor and 0.89 (p=0.0015) with both B cell CXCR5 and the pre-CRT CMR LV ejection fraction (LVEF) as predictors (Figure 2). The odds ratio for response per unit increase of B cell CXCR5 was 0.18 (p=0.027) in the latter model. Pre-CRT B cell CXCR5 expression was also correlated with the change in BNP six months after CRT (r=0.45, p=0.027) (Figure 3). Conclusions: B cell CXCR5 may be an important predictor of CRT response based on LV function and neurohormones even after adjustment for known predictors. Further investigation of B-cell CXCR5 for prognosis in HF patients undergoing CRT is of great interest.

IL-1β has emerged as a key mediator of the cytokine storm linked to high morbidity and mortality from COVID-19 and blockade of the IL-1 receptor (IL-1R) with Anakinra has entered clinical trials in COVID-19 subjects. Yet, knowledge of the specific immune cell subsets targeted by IL-1β and IL-1β-induced signaling pathways in humans is limited. Utilizing mass cytometry (CyTOF) of human peripheral blood mononuclear cells, we identified effector memory CD4 T cells and CD4-CD8low/-CD161+ T cells as the circulating immune subtypes with the greatest expression of p-NF-κB in response to IL-1β stimulation. Notably, CCR6 distinctly identified T cells most responsive to IL-1β. Other subsets including CD11c myeloid dendritic cells (mDCs), classical monocytes (CM), two subsets of natural killer cells (CD16-CD56brightCD161- and CD16-CD56dimCD161+) and a population of lineage- (Lin-) cells expressing CD161 and CD25 also showed IL-1β-induced expression of p-NF-κB. The IL-1R antagonist, Anakinra significantly inhibited IL-1β-induced p-NF-κB in the CCR6+ T cells and CD11c mDCs with a trending inhibition in CD14 monocytes and Lin-CD161+CD25+ cells. IL-1β also induced a rapid but much less robust increase in p-p38 expression as compared to p-NF-κB in the majority of these same immune cell subsets. Prolonged IL-1β stimulation greatly increased p-STAT3 and to a much lesser extent p-STAT1 and p-STAT5 in T cell subsets, monocytes, DCs and the Lin-CD161+CD25+ cells suggesting IL-1β-induced production of downstream STAT-activating cytokines, consistent with its role in cytokine storm. Interindividual heterogeneity and inhibition of this activation by Anakinra raises the intriguing possibility that assays to measure IL-1β-induced p-NF-κB in CCR6+ T cell subtypes could identify those at higher risk of cytokine storm and those most likely to benefit from Anakinra therapy.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Introduction: Aging is strongly associated with increased vascular inflammation, particularly in individuals over 65. Given that the development of coronary artery disease (CAD) is positively correlated with age-related inflammation, the precise distribution of myeloid subsets across different ages and CAD severity remains unclear. Objective: To investigate the influence of aging on myeloid heterogeneity using peripheral blood samples from the Coronary Assessment in Virginia (CAVA) cohort. Methods: PBMC samples from CAVA subjects (older ≥65, younger ≤64) were analyzed using AbSeq-based high-dimensional analysis. The Gensini score assessed CAD severity (high_CAD >32, low_CAD ≤ 6). Our analysis included 61 subjects in total, 33 older (18 high_CAD) and 28 younger (14 high_CAD). We examined age-wise associations across myeloid subsets. Results: We identified six major myeloid clusters: classical monocytes (cMo), intermediate monocytes (iMo), non-classical monocytes (nMo), plasmacytoid dendritic cells (pDC), conventional dendritic cells (cDC), and DC3. In all major clusters identified, the proportion of cMos (>75%) was consistently higher across all age groups. Although no significant differences were noted in frequencies of major myeloid populations with age, further analysis revealed significant age-related changes in subclusters. A notable decrease was observed in the cMo_CD33 hi CD9 hi (p=0.043) subsets in older individuals. Ingenuity Pathway Analysis of genes associated with this cluster indicated activation of IL-4, and IL-13 signaling pathways. In older subjects with high_CAD, significant decreases were identified in two specific CXCR3 + subsets, cMo_CD14 lo CD33 lo CXCR3 + (p=0.0001) and cMo_CCR6 + CXCR3 + (p=0.006) compared to those with low_CAD. Gensini correlation analysis in the older population also revealed a significant negative association with two cMo_CXCR3 + subsets. Within myeloid-specific genes in the older population, positive correlations with Gensini scores were observed for Ctsa, Flt3, Ncf1, Cd38, and C1Qb . Conversely, Nr4a1 , Cxcl1, Cxcl2, Cxcl8 , Cd83 , and Dusp2 showed negative correlations. We observed an increase in cMo_TLR4 lo (p=0.02) and a decrease in cMo_CD33 hi CD9 hi (p=0.006) in younger populations with high_CAD compared to low_CAD. Conclusion: Our finding highlights age-related changes in myeloid populations and their association with increased cardiovascular risk, suggesting potential targets for therapeutic intervention.

B cell-activating factor (BAFF) is a critical TNF-family cytokine that regulates homeostasis and peripheral tolerance of B2 cells. BAFF overproduction promotes autoantibody generation and autoimmune diseases. During obesity, BAFF is predominantly produced by white adipose tissue (WAT), and IgG autoantibodies against adipocytes are identified in the WAT of obese humans. However, it remains to be determined if the autoantibodies formed during obesity affect WAT remodeling and systemic insulin resistance. Here, we show that IgG autoantibodies are generated in high-fat diet (HFD)-induced obese mice that bind to apoptotic adipocytes and promote their phagocytosis by macrophages. Next, using murine models of obesity in which the gonadal WAT undergoes remodeling, we found that BAFF neutralization depleted IgG autoantibodies, increased the number of dead adipocytes, and exacerbated WAT inflammation and insulin resistance. RNA sequencing of the stromal vascular fraction from the WAT revealed decreased expression of immunoglobulin light-chain and heavy-chain variable genes suggesting a decreased repertoire of B cells after BAFF neutralization. Further, the B cell activation and the phagocytosis pathways were impaired in the WAT of BAFF-neutralized mice. In vitro , plasma IgG fractions from BAFF-neutralized mice reduced the phagocytic clearance of apoptotic adipocytes. Altogether, our study suggests that IgG autoantibodies developed during obesity, at least in part, dampens exacerbated WAT inflammation and systemic insulin resistance.

ABSTRACT Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a morbid fibrotic lung disease with limited treatment options. The pathophysiology of IPF remains poorly understood, and elucidation of the cellular and molecular mechanisms of IPF pathogenesis is key to the development of new therapeutics. B-1 cells are an innate B cell population which play an important role linking innate and adaptive immunity. B-1 cells spontaneously secrete natural IgM and prevent inflammation in several disease states. One class of these IgM recognize oxidation-specific epitopes (OSE), which have been shown to be generated in lung injury and to promote fibrosis. A main B-1 cell reservoir is the pleural space, adjacent to the typical distribution of fibrosis in IPF. In this study, we demonstrate that B-1 cells are recruited to the lung during injury where they secrete IgM to OSE (IgM OSE ). We also show that the pleural B-1 cell reservoir responds to lung injury through regulation of the chemokine receptor CXCR4. Mechanistically we show that the transcription factor Id3 is a novel negative regulator of CXCR4 expression. Using mice with B-cell specific Id3 deficiency, a model of increased B-1b cells, we demonstrate decreased bleomycin-induced fibrosis compared to littermate controls. Furthermore, we show that mice deficient in secretory IgM ( sIgM -/- ) have higher mortality in response to bleomycin-induced lung injury, which is partially mitigated through airway delivery of the IgM OSE E06. Additionally, we provide insight into potential mechanisms of IgM in attenuation of fibrosis through RNA sequencing and pathway analysis, highlighting complement activation and extracellular matrix deposition as key differentially regulated pathways.