This study describes the generation of knock-in mouse lines that express optogenetic activators or silencers in a CRE recombinase–dependent manner, and demonstrates the reliability and utility of these tools with in vivo and ex vivo light-induced activation and silencing of neuronal activity. Cell type–specific expression of optogenetic molecules allows temporally precise manipulation of targeted neuronal activity. Here we present a toolbox of four knock-in mouse lines engineered for strong, Cre-dependent expression of channelrhodopsins ChR2-tdTomato and ChR2-EYFP, halorhodopsin eNpHR3.0 and archaerhodopsin Arch-ER2. All four transgenes mediated Cre-dependent, robust activation or silencing of cortical pyramidal neurons in vitro and in vivo upon light stimulation, with ChR2-EYFP and Arch-ER2 demonstrating light sensitivity approaching that of in utero or virally transduced neurons. We further show specific photoactivation of parvalbumin-positive interneurons in behaving ChR2-EYFP reporter mice. The robust, consistent and inducible nature of our ChR2 mice represents a significant advance over previous lines, and the Arch-ER2 and eNpHR3.0 mice are to our knowledge the first demonstration of successful conditional transgenic optogenetic silencing. When combined with the hundreds of available Cre driver lines, this optimized toolbox of reporter mice will enable widespread investigations of neural circuit function with unprecedented reliability and accuracy.

Abstract Tau hyperphosphorylation and aggregation is a common feature of many dementia-causing neurodegenerative diseases. Tau can be phosphorylated at up to 85 different sites, and there is increasing interest in whether tau phosphorylation at specific epitopes, by specific kinases, plays an important role in disease progression. The AMP-activated protein kinase (AMPK) related enzyme NUAK1 been identified as a potential mediator of tau pathology, whereby NUAK1-mediated phosphorylation of tau at Ser356 prevents the degradation of tau by the proteasome, further exacerbating tau hyperphosphorylation and accumulation. This study provides a detailed characterisation of the association of p-tau Ser356 with progression of Alzheimer’s disease pathology, identifying a Braak stage-dependent increase in p-tau Ser356 protein levels and an almost ubiquitous presence in neurofibrillary tangles. We also demonstrate, using sub-diffraction-limit resolution array tomography imaging, that p-tau Ser356 co-localises with synapses in AD post-mortem brain tissue, increasing evidence that this form of tau may play important roles in AD progression. To assess the potential impacts of pharmacological NUAK inhibition in an ex vivo system that retains multiple cell types and brain-relevant neuronal architecture, we treated postnatal mouse organotypic brain slice cultures from wildtype or APP/PS1 littermates with the commercially available NUAK1/2 inhibitor WZ4003. Whilst there were no genotype specific effects, we found that WZ4003 results in a culture-phase dependent loss of total tau and p-tau Ser356, which corresponds with a reduction in neuronal and synaptic proteins. By contrast, application of WZ4003 to live human brain slice cultures results in a specific lowering of p-tau Ser356, alongside increased neuronal tubulin protein. This work identifies differential responses of postnatal mouse organotypic brain slice cultures and adult human brain slice cultures to NUAK1 inhibition that will be important to consider in future work developing tau-targeting therapeutics for human disease.

Background: The investigation of the human brain at cellular and microcircuit level remains challenging due to the fragile viability of neuronal tissue, inter- and intra-variability of the samples and limited availability of human brain material. New method: Here, we present an optimized work-up to use resected tissue from brain surgeries for live cell experiments in vitro. Comparison with existing methods: We provide a reworked, detailed protocol of the production, culturing and viral transduction of human organotypic brain slice cultures for research purposes. Results: We highlight the critical pitfalls of the culturing process of the human brain tissue and present results on viral expression, single-cell Patch-Clamp recordings, as well as multi-electrode array recordings over a prolonged period of time. Additionally, our statistics show that brain tissue from patients of any age and morbidity can be used for organotypic brain slice cultures if carefully selected. Conclusions: Organotypic brain slice cultures are of great value for basic neuroscience and disease modeling over a time course of three weeks.

Mitochondrial dysfunction contributes to the pathogenesis of Parkinson's disease but it is not clear why inherent mitochondrial defects lead specifically to the death of dopaminergic neurons of the mid brain. PINK1 is mitochondrial kinase and PINK1 mutations cause early onset Parkinson's disease. We found that in neuronal progenitors, PINK1 regulates mitochondrial morphology, mitochondrial contact to the endoplasmic reticulum (ER) and the phosphorylation of Miro1. A compensatory metabolic shift towards lipid synthesis provides mitochondria with the components needed for membrane renewal and oxidative phosphorylation, maintaining the mitochondrial network once mature. Cholesterol is increased by loss of PINK1, promoting overall membrane rigidity. This alters the distribution of phosphorylated DAT at synapses and impairs dopamine uptake. PINK1 is required for the phosphorylation of tyrosine hydroxylase at Ser19, dopamine and calcium homeostasis and dopaminergic pacemaking. We suggest a novel mechanism for PINK1 pathogenicity in Parkinson's disease in addition to but not exclusive of mitophagy. We also provide a basis for potential therapeutics by showing that low doses of the cholesterol depleting drug β-cyclodextrin reverse PINK1-specific phenotypes.

Abstract Rhythmic brain activity is critical to many brain functions and is sensitive to neuromodulation, but so far very few studies have investigated this activity on the cellular level in vitro in human brain tissue samples. This study reveals and characterizes a novel rhythmic network activity in the human neocortex. Using intracellular patch-clamp recordings of human cortical neurons, we identify large rhythmic depolarizations (LRDs) driven by glutamate release but not by GABA. These LRDs are intricate events made up of multiple depolarizing phases, occurring at ~0.3 Hz, have large amplitudes and long decay times. Unlike human tissue, rat neocortex layers 2/3 exhibit no such activity under identical conditions. LRDs are mainly observed in a subset of L2/3 interneurons that receive substantial excitatory inputs and are likely large basket cells based on their morphology. LRDs are highly sensitive to norepinephrine (NE) and acetylcholine (ACh), two neuromodulators that affect network dynamics. NE increases LRD frequency through β-adrenergic receptor activity while ACh decreases it via M 4 muscarinic receptor activation. Multi-electrode array recordings show that NE enhances and synchronizes oscillatory network activity, whereas ACh causes desynchronization. Thus, NE and ACh distinctly modulate LRDs, exerting specific control over human neocortical activity.

Murine organotypic brain slice cultures have been widely used in neuroscientific research and are offering the opportunity to study neuronal function under normal and disease conditions. Despite the broad application, the mechanisms governing the maturation of immature cortical circuits

Human cerebrospinal fluid (hCSF) have proven advantageous over conventional medium when culturing both rodent and human brain tissue. Increased excitability and synchronicity, similar to the active state exclusively recorded in vivo, reported in rodent slice and cell-cultures with hCSF as recording medium, indicates properties of the hCSF not matched by the artificial cerebrospinal fluid (aCSF) commonly used for electrophysiological recording. To evaluate the possible importance of using hCSF as electrophysiological recording medium of human brain tissue, we compared the general excitability in ex vivo human brain tissue slice cultures during perfusion with hCSF and aCSF. For measuring the general activity from a majority of neurons within neocortical and hippocampal human ex vivo slices we used a microelectrode array (MEA) recording technique with 252 electrodes covering an area of 3.2 x 3.2 mm2 and a second CMOS-based MEA with 4225 electrodes on a 2 x 2 mm2 area for detailed mapping of action potential waveforms. We found that hCSF increase the number of active neurons and the firing rate of the neurons in the slices as well as increasing the numbers of bursts while leaving the duration of the bursts unchanged. Interestingly, not only an increase in the overall activity in the slices was observed, but a reconfiguration of the network functionality could be detected with specific activation and inactivation of subpopulations of neuronal ensembles. In conclusion, hCSF is an important component to consider for future human tissue studies, especially for experiments designed to mimic the in vivo situation.

Abstract Murine organotypic brain slice cultures have been widely used in neuroscientific research and are offering the opportunity to study neuronal function under normal and disease conditions. Despite the brought application, the mechanisms governing the maturation of immature cortical circuits in vitro are not well understood. In this study, we present a detailed investigation into the development of the neocortex in vitro . Utilizing a holistic approach, we studied organotypic whole-hemisphere brain slice cultures from postnatal mice and tracked the development of the somatosensory area over a five-week period. Our analysis revealed the maturation of passive and active intrinsic properties of pyramidal cells together with their morphology, closely resembling in vivo development. Detailed Multi-electrode array (MEA) electrophysiological assessments and RNA expression profiling demonstrated stable network properties by two weeks in culture, followed by the transition of spontaneous activity towards more complex patterns including high-frequency oscillations. However, weeks 4 and 5 exhibited increased variability and initial signs of neuronal loss, highlighting the importance of considering developmental stages in experimental design. This comprehensive characterization is vital for understanding the temporal dynamics of the neocortical development in vitro , with implications for neuroscientific research methodologies, particularly in the investigation of diseases such as epilepsy and other neurodevelopmental disorders.

Abstract Key functions of Ca 2+ signaling in rodent microglia include monitoring the brain state or the surrounding neuronal activity and sensing the danger or damage in their vicinity. Microglial Ca 2+ dyshomeostasis is a disease hallmark in many mouse models of neurological disorders but the Ca 2+ signal properties of human microglia remain unknown. Using a newly developed toolbox, we analyzed in situ Ca 2+ signaling of decades-old human cortical microglia. The data revealed marked compartmentalization of Ca 2+ signals, with signal properties differing across the compartments and resident morphotypes. The basal Ca 2+ levels were low in ramified and high in ameboid microglia. The fraction of cells with ongoing Ca 2+ signaling, the fraction and the amplitude of process Ca 2+ signals and the duration of somatic Ca 2+ signals decreased when moving from ramified via hypertrophic to ameboid microglia. In contrast, the size of active compartments, the fraction and amplitude of somatic Ca 2+ signals and the duration of process Ca 2+ signals increased along this pathway.

Abstract Rhythmic brain activity has been implicated in many brain functions and it is sensible to neuromodulation, but so far very few studies have investigated this activity on the cellular level in vitro in human tissue samples. In this study we revealed and characterized a novel rhythmic network activity in human neocortex. Intracellular patch-clamp recordings showed that giant depolarizing potentials (GDPs) were frequently found in human cortical neurons. GDPs appeared in a low frequency band (∼ 0.3 Hz) similar to that described for slow oscillations in vivo and displayed large amplitudes and long decay times. Under the same experimental conditions, no rhythmic activity was found in L2/3 of the rat neocortex. GDPs were predominantly observed in a subset of L2/3 interneurons considered to be large basket cells based on previously described morphological features. In addition, GDPs are highly sensitive to norepinephrine (NE) and acetylcholine (ACh), two neuromodulators known to modulate low frequency oscillations. NE increased the frequency of the GDPs by enhancing β-adrenergic receptor activity while ACh decreased GDP frequency through M 4 muscarinic receptor-activation. Multi-electrode array (MEA) recordings demonstrated that NE promoted synchronous oscillatory network activity while the application of ACh led to a desynchronization of neuronal activity. Our data indicate that the human neocortex is more prone to generate slow wave activity, which was reflected by more pronounced GDPs in L2/3 large basket cells. The distinct modulation of GDPs and slow wave activity by NE and ACh exerts a specific modulatory control over the human neocortex.