Abstract Droplet microfluidics is a valuable method to ‘beat the odds’ in high throughput screening campaigns such as directed evolution, where valuable hits are infrequent and large library sizes are required. Absorbance-based sorting expands the landscape of range of enzyme families that can be subjected to droplet screening by expanding possible assays beyond fluorescence detection. However, absorbance activated droplet sorting (AADS) is currently ∼10-fold slower than typical fluorescence activated droplet sorting (FADS), meaning that, in comparison, a larger portion of sequence space is inaccessible due to throughput constraints. Here we improve AADS to reach kHz sorting speeds in an order of magnitude increase over previous designs, with close-to-ideal sorting accuracy. This is achieved by a combination of (i) the use of refractive index matching oil that improves signal quality by removal of side scattering (increasing the sensitivity of absorbance measurements); (ii) a sorting algorithm capable of reaching 4 kHz with an Arduino Due; and (iii) a chip design that transmits product detection better into sorting decisions without false positives, namely a single-layered inlet to space droplets further apart and injections of ‘bias oil’ providing a fluidic barrier preventing droplets from entering the incorrect sorting channel. The updated ultrahigh-throughput absorbance activated droplet sorter (UHT-AADS) increases the effective sensitivity of absorbance measurements through better signal quality at a speed that matches the more established fluorescence-activated sorting devices. Table of Contents Graphic

Abstract Enzyme engineering and discovery are crucial for a future sustainable bioeconomy, and harvesting new biocatalysts from large libraries through directed evolution or functional metagenomics requires accessible, rapid assays. Ultra-high throughput screening can often require an optical readout, leading to the use of model substrates that may not accurately report on activity for the target reaction and may require bespoke synthesis. In contrast, coupled assays represent a modular ‘plug-and-play’ system, where any pairing of enzyme/substrate may be investigated, if the reaction can produce a common intermediate which links the catalytic reaction to a detection cascade readout. Here we establish a detection cascade, producing a fluorescent readout in response to NAD(P)H via glutathione reductase and a subsequent thiol-mediated uncaging reaction, with a 30 nM detection limit. We demonstrate its utility for the glycosidase AxyAgu 115A (producing monosaccharides from a natural biofuel feedstock) and report a three orders of magnitude improved sensitivity compared to absorbance-based systems, so that less than one catalytic turnover per enzyme molecule expressed from a single cell is detectable. These advantages are brought to bear in plate formats, but also in picoliter emulsion droplets, where enrichments of 950-fold suggest that large libraries can be interrogated against a specific query substrate.

Abstract Engineering enzyme biocatalysts for higher efficiency is key to enabling sustainable, ‘green’ production processes for the chemical and pharmaceutical industry. This challenge can be tackled from two angles: by directed evolution, based on labor-intensive experimental testing of enzyme variant libraries, or by computational methods, where sequence-function data are used to predict biocatalyst improvements. Here, we combine both approaches into a two-week workflow, where ultra-high throughput screening of a library of imine reductases (IREDs) in microfluidic devices provides not only selected ‘hits’, but also long-read sequence data linked to fitness scores of >17 thousand enzyme variants. We demonstrate engineering of an IRED for chiral amine synthesis by mapping functional information in one go, ready to be used for interpretation and extrapolation by protein engineers with the help of machine learning (ML). We calculate position-dependent mutability and combinability scores of mutations and comprehensively illuminate a complex interplay of mutations driven by synergistic, often positively epistatic effects. Interpreted by easy-to-use regression and tree-based ML algorithms designed to suit the evaluation of random whole-gene mutagenesis data, 3-fold improved ‘hits’ obtained from experimental screening are extrapolated further to give up to 23-fold improvements in catalytic rate after testing only a handful of designed mutants. Our campaign is paradigmatic for future enzyme engineering that will rely on access to large sequence-function maps as profiles of the way a biocatalyst responds to mutation. These maps will chart the way to improved function by exploiting the synergy of rapid experimental screening combined with ML evaluation and extrapolation.

Abstract Droplet microfluidics allows one to address the ever-increasing demand to screen large libraries of biological samples. Absorbance spectroscopy complements the golden standard of fluorescence detection by label free target identification and providing more quantifiable data. However, this is limited by speed and sensitivity. In this paper we increase the speed of sorting by including acoustofluidics, achieving sorting rates of target droplets of 1 kHz. We improved the devices design for detection of absorbance using fibre-based interrogation of samples with integrated lenses in the microfluidic PDMS device for focusing and collimation of light. This optical improvement reduces the scattering and refraction artefacts, improving the signal quality and sensitivity. The novel design allows us to overcome limitations based on dielectrophoresis sorting, such as droplet size dependency, material and dielectric properties of samples. Our acoustic activated absorbance sorter removes the need for offset dyes or matching oils and sorts about a magnitude faster than current absorbance sorter.

ABSTRACT The ability of unevolved amino acid sequences to become biological catalysts was key to the emergence of life on Earth. However, billions of years of evolution separate complex modern enzymes from their simpler early ancestors. To study how unevolved sequences can develop new functions, we screened for enzymatic activity in a collection of > 1 million novel sequences based on a de novo 4-helix bundle library of semi-random sequences. To mirror evolutionary selection for biological function, we screened the collection using ultrahigh-throughput droplet microfluidics to identify features that yield phosphoesterase activity. Characterization of active hits demonstrated that acquiring new function required a large jump in sequence space: screening enriched for truncations that removed > 40% of the protein chain and introduced a catalytically important cysteine. The truncated protein dimerized into a dynamic α-helical structure, consistent with the idea that gain of function was accompanied by an increase in structural dynamics relative to the parental 4-helix bundle. The purified protein catalyzes the hydrolysis of a range of phosphodiesters, with the greatest activity toward the biological second messenger cyclic AMP (cAMP). The novel cAMPase is a manganese-dependent metalloenzyme and catalyzes cAMP hydrolysis with a rate acceleration on the order of 10 9 and catalytic proficiency on the order of 10 14 M −1 , comparable to large enzymes shaped by billions of years of evolution. These findings suggest that fragmentation to modular primordial peptides can be a fertile avenue for introducing structural and functional diversity into proteins. GRAPHICAL ABSTRACT