Engineered DNA will slow the growth of a host cell if it redirects limiting resources or otherwise interferes with homeostasis. Populations of engineered cells can rapidly become dominated by "escape mutants" that evolve to alleviate this burden by inactivating the intended function. Synthetic biologists working with bacteria rely on genetic parts and devices encoded on plasmids, but the burden of different engineered DNA sequences is rarely characterized. We measured how 301 BioBricks on high-copy plasmids affected the growth rate of

Engineered DNA will slow the growth of a host cell if it redirects limiting resources or otherwise interferes with homeostasis. Escape mutants that alleviate this burden can rapidly evolve and take over cell populations, making genetic engineering less reliable and predictable. Synthetic biologists often use genetic parts encoded on plasmids, but their burden is rarely characterized. We measured how 301 BioBrick plasmids affected Escherichia coli growth and found that 59 (19.6%) were burdensome, primarily because they depleted the limited gene expression resources of host cells. Overall, no BioBricks reduced the growth rate of E. coli by >45%, which agreed with a population genetic model that predicts such plasmids should be unclonable. We made this model available online for education ( https://barricklab.org/burden-model ) and added our burden measurements to the iGEM Registry. Our results establish a fundamental limit on what DNA constructs and genetic modifications can be successfully engineered into cells.

Abstract Summary The design of two overlapping genes in a microbial genome is an emerging technique for adding more reliable control mechanisms in engineered organisms for increased safety. The design of functional gene pairs is a challenging procedure and computational design tools are used to improve the efficiency to deploy successful designs in genetically engineered systems. GENTANGLE (Gene Tuples ArraNGed in overLapping Elements) is a high performance containerized pipeline for the computational design of two overlapping genes translated in different reading frames of the genome. This new software package can be used to design and test gene entanglements for microbial engineering projects using arbitrary sets of user specified gene pairs. Availability and Implementation The GENTANGLE source code and its submodules are freely available on GitHub at https://github.com/BiosecSFA/gentangle . The DATANGLE (DATA for genTANGLE) repository contains related data and results, and is freely available on GitHub at https://github.com/BiosecSFA/datangle . The GENTANGLE repository wiki contains detailed instructions on how to use the container and the different components of software and data, including reproducing the results. The code is licensed under the GNU Affero General Public License version 3 ( https://www.gnu.org/licenses/agpl.html ). Contact martimartine1@llnl.gov and allen99@llnl.gov

Mobile genetic elements drive evolution by disrupting genes and rearranging genomes. Eukaryotes have evolved epigenetic mechanisms, including DNA methylation and RNA interference, that silence mobile elements and thereby preserve the integrity of their genomes. We created an artificial reprogrammable epigenetic system based on CRISPR interference to give engineered bacteria a similar line of defense against transposons and other selfish elements in their genomes. We demonstrate that this CRISPR interference against mobile elements (CRISPRi-ME) approach can be used to simultaneously repress two different transposon families in Escherichia coli, thereby increasing the evolutionary stability of costly protein expression. We further show that silencing a transposon in Acinetobacter baylyi ADP1 reduces mutation rates by a factor of five, nearly as much as deleting all copies of this element from its genome. By deploying CRISPRi-ME on a broad-host-range vector we have created a generalizable platform for stabilizing the genomes of engineered bacterial cells for applications in metabolic engineering and synthetic biology.

ABSTRACT The development of synthetic biological circuits that maintain functionality over application relevant timescales remains a significant challenge. Here, we employed synthetic overlapping sequences in which one gene is encoded or “entangled” entirely within an alternative reading frame of another gene. In this design, the toxin-encoding relE was entangled within ilvA , which encodes threonine deaminase, an enzyme essential for isoleucine biosynthesis. A functional entanglement construct was obtained upon modification of the ribosome binding site of the internal relE gene. Using this optimized design, we found that the selection pressure to maintain functional IlvA stabilized the production of burdensome RelE for over 130 generations, which compares favorably with the most stable kill-switch circuits developed to date. This stabilizing effect was achieved through a complete alteration of the mutational landscape such that mutations inactivating the entangled genes were disfavored. Instead, the majority of lineages accumulated mutations within the regulatory region of ilvA . By reducing baseline relE expression, these more ‘benign’ mutations lowered circuit burden, which suppressed the accumulation of relE inactivating mutations, thereby prolonging kill-switch function. Overall, this work demonstrates the utility of sequence entanglement paired with an adaptive laboratory evolution campaign to increase the evolutionary stability of burdensome synthetic circuits.

ABSTRACT Mechanistic understanding of interactions in many host-microbe systems, including the honey bee microbiome, is limited by a lack of easy-to-use genome engineering approaches. To this end, we demonstrate a one-step genome engineering approach for making gene deletions and insertions in the chromosomes of honey bee gut bacterial symbionts. Electroporation of linear or non-replicating plasmid DNA containing an antibiotic resistance cassette flanked by regions with homology to a symbiont genome reliably results in chromosomal integration. This lightweight approach does not require expressing any exogenous recombination machinery. The high concentrations of large DNAs with long homology regions needed to make the process efficient can be readily produced using modern DNA synthesis and assembly methods. We use this approach to knock out genes, including genes involved in biofilm formation, and insert fluorescent protein genes into the chromosome of the betaproteobacterial bee gut symbiont Snodgrassella alvi . We are also able to engineer the genomes of multiple strains of S. alvi and another species, Snodgrassella communis , which is found in the bumble bee gut microbiome. Finally, we use the same method to engineer the chromosome of another bee symbiont, Bartonella apis , which is an alphaproteobacterium. As expected, gene knockout in S. alvi using this approach is recA -dependent, suggesting that this straightforward procedure can be applied to other microbes that lack convenient genome engineering methods. IMPORTANCE Honey bees are ecologically and economically important crop pollinators with bacterial gut symbionts that influence their health. Microbiome-based strategies for studying or improving bee health have utilized wild-type or plasmid-engineered bacteria. We demonstrate that a straightforward, single-step method can be used to insert cassettes and replace genes in the chromosomes of multiple bee gut bacteria. This method can be used for investigating the mechanisms of host-microbe interactions in the bee gut community and stably engineering symbionts that benefit pollinator health.

One goal of synthetic biology is to improve the efficiency and predictability of living cells by removing extraneous genes from their genomes. We demonstrate improved methods for engineering the genome of the metabolically versatile and naturally transformable bacterium Acinetobacter baylyi ADP1 and apply them to a genome streamlining project. In Golden Transformation, linear DNA fragments constructed by Golden Gate Assembly are directly added to cells to create targeted deletions, edits, or additions to the chromosome. We tested the dispensability of 55 regions of the ADP1 chromosome using Golden Transformation. The 19 successful multiple-gene deletions ranged in size from 21 to 183 kilobases and collectively accounted for 24.6% of its genome. Deletion success could only be partially predicted on the basis of a single-gene knockout strain collection and a new Tn-Seq experiment. We further show that ADP1's native CRISPR/Cas locus is active and can be retargeted using Golden Transformation. We reprogrammed it to create a CRISPR-Lock, which validates that a gene has been successfully removed from the chromosome and prevents it from being reacquired. These methods can be used together to implement combinatorial routes to further genome streamlining and for more rapid and assured metabolic engineering of this versatile chassis organism.

ABSTRACT Toolkits of plasmids and genetic parts streamline the process of assembling DNA constructs and engineering microbes. Many of these kits were designed with specific industrial or laboratory microbes in mind. For researchers interested in non-model microbial systems, it is often unclear which tools and techniques will function in newly isolated strains. To address this challenge, we designed the Pathfinder toolkit for quickly determining the compatibility of a bacterium with different plasmid components. Pathfinder plasmids combine three different broad-host-range origins of replication with multiple antibiotic resistance cassettes and reporters, so that sets of parts can be rapidly screened through multiplex conjugation. We first tested these plasmids in Escherichia coli , a strain of Sodalis praecaptivus that colonizes insects, and a Rosenbergiella isolate from leafhoppers. Then, we used the Pathfinder plasmids to engineer previously unstudied bacteria from the family Orbaceae that were isolated from several fly species. Engineered Orbaceae strains were able to colonize Drosophila melanogaster and could be visualized in fly guts. Orbaceae are common and abundant in the guts of wild-caught flies but have not been included in laboratory studies of how the Drosophila microbiome affects fly health. Thus, this work provides foundational genetic tools for studying new host-associated microbes, including bacteria that are a key constituent of the gut microbiome of a model insect species. IMPORTANCE To fully understand how microbes have evolved to interact with their environments, one must be able to modify their genomes. However, it can be difficult and laborious to discover which genetic tools and approaches work for a new isolate. Bacteria from the recently described Orbaceae family are common in the microbiomes of insects. We developed the Pathfinder plasmid toolkit for testing the compatibility of different genetic parts with newly cultured bacteria. We demonstrate its utility by engineering Orbaceae strains isolated from flies to express fluorescent proteins and characterizing how they colonize the Drosophila melanogaster gut. Orbaceae are widespread in Drosophila in the wild but have not been included in laboratory studies examining how the gut microbiome affects fly nutrition, health, and longevity. Our work establishes a path for genetic studies aimed at understanding and altering interactions between these and other newly isolated bacteria and their hosts.

Honey bees are economically relevant pollinators experiencing population declines due to a number of threats. As in humans, the health of bees is influenced by their microbiome. The bacterium Snodgrassella alvi is a key member of the bee gut microbiome and has a role in excluding pathogens. Despite this importance, there are not currently any easy-to-use methods for modifying the S. alvi chromosome to study its genetics. To solve this problem, we developed a one-step procedure that uses electroporation and homologous recombination, which we term SnODIFY (Snodgrassella-specific One-step gene Deletion or Insertion to alter FunctionalitY). We used SnODIFY to create seven single-gene knockout mutants and recovered mutants for all constructs tested. Nearly all transformants had the designed genome modifications, indicating that SnODIFY is highly accurate. Mutant phenotypes were validated through knockout of Type 4 pilus genes, which led to reduced biofilm formation. We also used SnODIFY to insert heterologous sequences into the genome by integrating fluorescent protein-coding genes. Finally, we confirmed that genome modification is dependent on S. alvi's endogenous RecA protein. Because it does not require expression of exogenous recombination machinery, SnODIFY is a straightforward, accurate, and lightweight method for genome editing in S. alvi. This workflow can be used to study the functions of S. alvi genes and to engineer this symbiont for applications including protection of honey bee health.