Experimental designs that take advantage of high-throughput sequencing to generate datasets include RNA sequencing (RNA-seq), chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq), sequencing of 16S rRNA gene fragments, metagenomic analysis and selective growth experiments. In each case the underlying data are similar and are composed of counts of sequencing reads mapped to a large number of features in each sample. Despite this underlying similarity, the data analysis methods used for these experimental designs are all different, and do not translate across experiments. Alternative methods have been developed in the physical and geological sciences that treat similar data as compositions. Compositional data analysis methods transform the data to relative abundances with the result that the analyses are more robust and reproducible.Data from an in vitro selective growth experiment, an RNA-seq experiment and the Human Microbiome Project 16S rRNA gene abundance dataset were examined by ALDEx2, a compositional data analysis tool that uses Bayesian methods to infer technical and statistical error. The ALDEx2 approach is shown to be suitable for all three types of data: it correctly identifies both the direction and differential abundance of features in the differential growth experiment, it identifies a substantially similar set of differentially expressed genes in the RNA-seq dataset as the leading tools and it identifies as differential the taxa that distinguish the tongue dorsum and buccal mucosa in the Human Microbiome Project dataset. The design of ALDEx2 reduces the number of false positive identifications that result from datasets composed of many features in few samples.Statistical analysis of high-throughput sequencing datasets composed of per feature counts showed that the ALDEx2 R package is a simple and robust tool, which can be applied to RNA-seq, 16S rRNA gene sequencing and differential growth datasets, and by extension to other techniques that use a similar approach.

ABSTRACT Phaeodactylum tricornutum is a marine diatom with a growing genetic toolbox available and is being used in many synthetic biology applications. While most of the genome has been assembled, the currently available genome assembly is not a completed telomere-to-telomere assembly. Here, we used Oxford Nanopore long reads to build a telomere-to-telomere genome for Phaeodactylum tricornutum . We developed a graph-based approach to extract all unique telomeres, and used this information to manually correct assembly errors. In total, we found 25 nuclear chromosomes that comprise all previously assembled fragments, in addition to the chloroplast and mitochondrial genomes. We found that chromosome 19 has filtered long-read coverage and a quality estimate that suggests significantly less haplotype sequence variation than the other chromosomes. This work improves upon the previous genome assembly and provides new opportunities for genetic engineering of this species, including creating designer synthetic chromosomes.

ABSTRACT D. radiodurans has become an attractive microbial platform for the study of extremophile biology and industrial bioproduction. To improve the genomic manipulation and tractability of this species, the development of tools for whole genome engineering and design is necessary. Here, we report the development of a simple and robust conjugation-based transformation system from E. coli to D. radiodurans allowing for the introduction of stable, replicating plasmids expressing antibiotic resistance markers. Using this method with nonreplicating plasmids, we developed a protocol for creating sequential gene deletions in D. radiodurans by targeting re-striction-modification system genes. Importantly, we demonstrated a conjugation-based method for cloning the large (178 kb), high G+C content MP1 megaplasmid from D. radiodurans in E. coli . The conjugation-based tools described here will facilitate the development of D. radiodurans strains with synthetic genomes for biological studies and industrial applications. Abstract Figure

ABSTRACT The CRISPR/Cas9 nuclease from Streptococcus pyogenes (SpCas9) can be used with single guide RNAs (sgRNAs) as a sequence-specific antimicrobial agent and as a genome-engineering tool. However, current bacterial sgRNA activity models poorly predict SpCas9/sgRNA activity and are not generalizable, possibly because the underlying datasets used to train the models do not accurately measure SpCas9/sgRNA cleavage activity and cannot distinguish cleavage activity from toxicity. We solved this problem by using a two-plasmid positive selection system to generate high-quality biologically-relevant data that more accurately reports on SpCas9/sgRNA cleavage activity and that separates activity from toxicity. We developed a new machine transfer learning architecture (crisprHAL) that can be trained on existing datasets and that shows marked improvements in sgRNA activity prediction accuracy when transfer learning is used with small amounts of high-quality data. The crisprHAL model recapitulates known SpCas9/sgRNA-target DNA interactions and provides a pathway to a generalizable sgRNA bacterial activity prediction tool.

ABSTRACT Recent studies have revealed a role for RNA in the repair of DNA double-strand breaks. Here, we show that the asymmetric DNA overhangs generated by the small TevSaCas9 dual nuclease informs a simple and robust editing strategy in human cells whereby Polθ and Rad52 are recruited to repair the double-strand break. The 2-nt, 3’ DNA overhang generated by the I-TevI nuclease domain of TevSaCas9 hybridizes with the 3’ end of a co-localized repair template guide RNA to specifically license repair. Substitutions that destabilize the repair duplex reduce editing efficiency. Targeted RNA-templated repair (rep-editing) harnesses cellular RNA-based DNA repair pathways to introduce precise nucleotide edits, deletions and insertions in human cells with high efficiency and fidelity independent of co-delivered repair functions. The small size of TevSaCas9 and RNA repair template offers delivery advantages over size-constrained or multi-component editing systems.

Abstract The Ku70/80 heterodimer is a key player in non-homologous end-joining DNA repair but has also been involved in other cellular functions like telomere regulation and maintenance, in which Ku’s role is not fully characterized. It was previously reported that knockout of Ku80 in a human cell line results in lethality, but the underlying cause of Ku essentiality in human cells has yet to be fully explored. Here, we established conditional Ku70 knockout cells to study the essentiality of Ku70 function. Endogenous Ku70 knockout was achieved using CRISPR/Cas9 editing in cells where Ku70 expression was maintained through integration of an HA-tagged Ku70 cDNA under the control of a doxycycline-inducible promoter. Ku70 conditional knockout cell lines were identified via western blotting, and edits were validated by Sanger sequencing. We visually observed cell death in Ku70 knockout cells 8-10 days post Ku70-HA depletion, and loss of viability following Ku depletion was quantified using crystal violet assays. Interestingly, assessment of telomere length in Ku70 knockout cells using telomere restriction fragment analyses did not reveal any changes in average telomere length following Ku70-HA depletion. Immunofluorescence analysis used to assess γH2AX foci accumulation as a measure of double-stranded DNA breaks following Ku70-HA depletion allowed us to conclude that increased DNA damage is not the driving cause of loss of cell viability. Finally, quantitative proteome analysis of Ku70 knockout cells following Ku70-HA depletion identified a number of pathways and proteins that are significantly dysregulated following the loss of Ku70, including processes which Ku function has been previously associated with such as cell cycle/mitosis, RNA related processes, and translation/ribosome biogenesis. Overall, this conditional Ku70 knockout system reveals that loss of Ku affects multiple cellular processes and pathways and suggests that Ku plays critical roles in other cellular processes beyond DNA repair and telomere maintenance to maintain cell viability. Author Summary The Ku70/80 heterodimer is a key player in non-homologous end-joining DNA repair, where it acts as a scaffold for other repair factors needed to process double-stranded DNA breaks. Ku has also been involved in other cellular functions like telomere regulation and maintenance, in which Ku’s role is not fully characterized. Previous data suggest that while loss of Ku70/80 can be tolerated in other species, Ku is essential to humans. We have established a conditional Ku70 knockout in HEK293 cells to evaluate the basis of Ku essentiality in human cells. While we observed loss of cell viability upon Ku depletion, we did not observe significant changes in telomere length nor did we record lethal levels of DNA damage upon loss of Ku, suggesting that the reasons for the loss of viability is not linked to the functions of Ku in DNA repair or at telomeres. Analysis of global proteome changes following Ku70 depletion revealed dysregulations of several cellular pathways including cell cycle/mitosis, RNA related processes, and translation/ribosome biogenesis. Our study reveals that loss of Ku affects multiple cellular processes and pathways and suggests that Ku plays critical roles in cellular processes beyond DNA repair and telomere maintenance to maintain cell viability.

The model diatom Phaeodactylum tricornutum is an attractive candidate for synthetic biology applications. Development of auxotrophic strains of P. tricornutum would provide alternative selective markers to commonly used antibiotic resistance genes. Here, using CRISPR/Cas9, we show successful editing of genes in the uracil, histidine, and tryptophan biosynthetic pathways. Editing events are characterized by loss of heterozygosity and by the occurrence of large deletions of up to ~2.7-kb centred on the editing site. The uracil and histidine-requiring phenotypes can be complemented by plasmid-based copies of the intact genes after curing of the Cas9-editing plasmid. Growth of uracil auxotrophs on media supplemented with 5-FOA and uracil results in loss of the complementing plasmid, providing a facile method for plasmid curing with potential applications in strain engineering and CRISPR editing. Metabolomic characterization of uracil auxotrophs revealed changes in cellular orotate concentrations consistent with partial or complete loss of orotate phosphoribosyl transferase activity in knockout strains. Our results expand the range of P. tricornutum auxotrophic strains and demonstrate that auxotrophic complementation markers provide a viable alternative to traditionally used antibiotic selection markers. Plasmid-based auxotrophic markers should expand the range of genome engineering applications and provide a means for biocontainment of engineered P. tricornutum strains.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

ABSTRACT Limiting the spread of synthetic genetic information outside of the intended use is essential for applications where biocontainment is critical. In particular, biocontainment of engineered probiotics and plasmids that are excreted from the mammalian gastrointestinal tract is needed to prevent escape and acquisition of genetic material that could confer a selective advantage to microbial communities. Here, we built a simple and lightweight biocontainment system that post-translationally activates a site-specific DNA endonuclease to degrade DNA at 18°C and not at higher temperatures. We constructed an orthogonal set of temperature sensitive-meganucleases, or TSMs, by inserting the yeast VMA1 L212P temperature-sensitive intein into the coding regions of LAGLIDADG homing endonucleases. We showed that the TSMs eliminated plasmids carrying the cognate TSM target site from laboratory strains of Escherichia coli at the permissive 18°C but not at higher restrictive temperatures. Plasmid elimination is dependent on both TSM endonuclease activity and intein splicing. We demonstrated that TSMs eliminated plasmids from the E. coli Nissle 1917 strain after passage through the mouse gut when fecal resuspensions were incubated at 18°C but not at 37°C. Collectively, our data demonstrates the potential of thermoregulated meganucleases as a means of restricting engineered plasmids and probiotics to the mammalian gut.

ABSTRACT Metagenomic sequence represents an untapped source of genetic novelty, particularly for conjugative systems that could be used for plasmid-based delivery of Cas9-derived antimicrobial agents. However, unlocking the functional potential of conjugative systems purely from metagenomic sequence requires the identification of suitable candidate systems as starting scaffolds for de novo DNA synthesis. Here, we developed a bioinformatics approach that searches through the metagenomic ‘trash bin’ for conjugative systems present on contigs that are typically excluded from common metagenomic analysis pipelines. Using a human metagenomic gut dataset representing 2805 taxonomically distinct units, we identified 1598 contigs containing conjugative systems with a differential distribution in human cohorts. We synthesized de novo an entire Citrobacter spp. conjugative system of 54 kb and containing at least 47 genes, pCitro, and found that pCitro conjugates from Escherichia coli to Citrobacter rodentium with a 30-fold higher frequency than to E. coli , and is compatible with Citrobacter resident plasmids. Mutations in the traV and traY conjugation components of pCitro inhibited conjugation. We showed that pCitro can be re-purposed as an antimicrobial delivery agent by programming it with the TevCas9 nuclease and Citrobacter -specific sgRNAs to kill C. rodentium . Our study reveals a trove of uncharacterized conjugative systems in metagenomic data and describes an experimental framework to animate these large genetic systems as novel target-adapted delivery vectors for Cas9-based editing of bacterial genomes.

Storage and manipulation of large DNA fragments is crucial for synthetic biology applications, yet DNA with high G+C content can be unstable in many host organisms. Here, we report the development of Sinorhizobium meliloti as a new universal host that can store DNA, including high G+C content, and mobilize DNA to Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, and the eukaryotic microalgae Phaeodactylum tricornutum. We deleted the S. meliloti hsdR restriction-system to enable DNA transformation with up to 1.4 x 105 efficiency. Multi-host and multi-functional shuttle vectors (MHS) were constructed and shown to stably replicate in S. meliloti, E. coli, S. cerevisiae, and P. tricornutum, with a copy-number inducible E. coli origin for isolating plasmid DNA. Crucially, we demonstrated that S. meliloti can act as a universal conjugative donor for MHS plasmids with a cargo of at least 62 kb of G+C rich DNA derived from Deinococcus radiodurans.