Plasma membrane compartments, delimited by transmembrane proteins anchored to the membrane skeleton (anchored-protein picket model), would provide the membrane with fundamental mosaicism because they would affect the movement of practically all molecules incorporated in the cell membrane. Understanding such basic compartmentalized structures of the cell membrane is critical for further studies of a variety of membrane functions. Here, using both high temporal-resolution single particle tracking and single fluorescent molecule video imaging of an unsaturated phospholipid, DOPE, we found that plasma membrane compartments generally exist in various cell types, including CHO, HEPA-OVA, PtK2, FRSK, HEK293, HeLa, T24 (ECV304), and NRK cells. The compartment size varies from 30 to 230 nm, whereas the average hop rate of DOPE crossing the boundaries between two adjacent compartments ranges between 1 and 17 ms. The probability of passing a compartment barrier when DOPE is already at the boundary is also cell-type dependent, with an overall variation by a factor of approximately 7. These results strongly indicate the necessity for the paradigm shift of the concept on the plasma membrane: from the two-dimensional fluid continuum model to the compartmentalized membrane model in which its constituent molecules undergo hop diffusion over the compartments.

Receptor dimerization is important for many signaling pathways. However, the monomer-dimer equilibrium has never been fully characterized for any receptor with a 2D equilibrium constant as well as association/dissociation rate constants (termed super-quantification). Here, we determined the dynamic equilibrium for the N-formyl peptide receptor (FPR), a chemoattractant G protein-coupled receptor (GPCR), in live cells at 37°C by developing a single fluorescent-molecule imaging method. Both before and after liganding, the dimer-monomer 2D equilibrium is unchanged, giving an equilibrium constant of 3.6 copies/µm(2), with a dissociation and 2D association rate constant of 11.0 s(-1) and 3.1 copies/µm(2)s(-1), respectively. At physiological expression levels of ∼2.1 receptor copies/µm(2) (∼6,000 copies/cell), monomers continually convert into dimers every 150 ms, dimers dissociate into monomers in 91 ms, and at any moment, 2,500 and 3,500 receptor molecules participate in transient dimers and monomers, respectively. Not only do FPR dimers fall apart rapidly, but FPR monomers also convert into dimers very quickly.

Abstract Using the ultrafast camera system and new theories for hop diffusion described in the companion paper, we for the first time demonstrated that membrane molecules undergo hop diffusion among the compartments in the bulk basal plasma membrane (PM), with virtually the same compartment sizes (108 nm) as those in the bulk apical PM and the same dwell lifetimes within a compartment (10 and 24 ms for the phospholipid and transferrin receptor, respectively), suggesting that the basic structures and molecular dynamics are very similar in the bulk regions of the apical and basal PMs. Ultrafast PALM and single-molecule imaging revealed that the focal adhesion (FA) is mostly a fluid membrane, partitioned into ∼74-nm compartments where transferrin receptor and β3 integrin undergo hop diffusion, and that the FA membrane is sparsely dotted with 51-nm diameter paxillin islands, where many other FA proteins probably assemble (compartmentalized archipelago model). β3 integrin intermittently associates with the paxillin islands, dynamically linking them to the extracellular matrix. Summary An ultrafast camera with single fluorescent-molecule sensitivities developed by Fujiwara et al. reveals that the focal adhesion membrane is dotted with protein islands and partitioned for molecular hop diffusion, and integrin β3 molecules become temporarily immobilized at the islands.

Abstract Knowledge on the distribution and dynamics of glycosylation enzymes in the Golgi is essential for better understanding this modification. Here, using a combination of CRISPR/Cas9 knockin technology and super-resolution microscopy, we show that the Golgi complex is assembled by a number of small ‘Golgi units’ that have 1-3 μm in diameter. Each Golgi unit contains small domains of glycosylation enzymes which we call ‘zones’. The zones of N- and O-glycosylation enzymes are colocalised. However, they are less colocalised with the zones of a glycosaminoglycan synthesizing enzyme. Golgi units change shapes dynamically and the zones of glycosylation enzymes rapidly move near the rim of the unit. Photobleaching analysis indicates that a glycosaminoglycan synthesizing enzyme moves between units. Depletion of giantin dissociates units and prevents the movement of glycosaminoglycan synthesizing enzymes, which leads to insufficient glycosaminoglycan synthesis. Thus, we show the structure-function relationship of the Golgi and its implications in human pathogenesis.

Abstract Using single-molecule imaging with enhanced time resolutions down to 5 ms, we found that CD59-cluster rafts and GM1-cluster rafts stably induced in the outer leaflet of the plasma membrane (PM), which triggered the activation of Lyn, H-Ras, and ERK, continually recruited Lyn and H-Ras right beneath them in the inner leaflet, with dwell lifetimes of <0.1 s. The detection was possible due to the enhanced time resolutions employed here. The recruitment depended on the PM cholesterol and saturated alkyl chains of Lyn and H-Ras, whereas it was blocked by the non-raftophilic transmembrane protein moiety and unsaturated alkyl chains linked to the inner-leaflet molecules. Since GM1-cluster rafts recruited Lyn and H-Ras as efficiently as CD59-cluster rafts, and the protein moieties of Lyn and H-Ras were not required for the recruitment, we conclude that the transbilayer raft phases induced by the outer-leaflet stabilized rafts recruit lipid-anchored signaling molecules by lateral raft-lipid interactions, and thus serve as a key signal transduction platform. Summary High-speed single-molecule imaging indicated that CD59-cluster rafts and GM1-cluster rafts stably induced in the plasma membrane outer leaflet generated nano-scale transbilayer raft phases, which continually and transiently recruited Lyn and H-Ras in the inner leaflet by cooperative raft-lipid interactions.

Abstract The spatial resolution of fluorescence microscopy has recently been greatly improved. However, its temporal resolution has not been improved much, despite its importance for examining living cells. Here, by developing an ultrafast camera system, we achieved the world’s highest time resolutions for single fluorescent-molecule imaging of 33 (100) µs (multiple single molecules simultaneously) with a single-molecule localization precision of 34 (20) nm for Cy3 (best dye found), and for PALM data acquisition of a view-field of 640×640 pixels at 1 kHz with a single-molecule localization precision of 29 nm for mEos3.2. Both are considered the ultimate rates with available probes. This camera system (1) successfully detected fast hop diffusion of membrane molecules in the plasma membrane, detectable previously only by using less preferable 40-nm gold probes and bright-field microscopy, and (2) enabled PALM imaging of the entire live cell, while revealing meso-scale dynamics and structures, caveolae and paxillin islands in the focal adhesion, proving its usefulness for cell biology research. Summary An ultrafast camera developed by Fujiwara et al. allows single fluorescent-molecule imaging every 33 μs with a localization precision of 34 nm (every 100 μs; 20 nm), and enables ultrafast PALM imaging of whole live cells.

Transmembrane adhesion receptors at the cell surface, such as CD44, are often equipped with modules to interact with the extracellular-matrix(ECM) and the intra-cellular cytoskeletal machinery. CD44 has been recently shown to compartmentalize the membrane into domains by acting as membrane pickets, facilitating the function of signaling receptors. While spatial organization and diffusion studies of membrane proteins are usually conducted separately, here we combine observations of organization and diffusion by using high spatio-temporal resolution imaging on living cells to reveal a hierarchical organization of CD44. CD44 is present in a meso-scale meshwork pattern where it exhibits enhanced confinement and is enriched in nano-clusters of CD44 along its boundaries. This nanoclustering is orchestrated by the underlying cortical actin dynamics. Interaction with actin is mediated by specific segments of the intracellular-domain(ICD). This influences the organization of the protein at the nano-scale, generating a selective requirement for formin over Arp2/3-based actin-nucleation machinery. The extracellular-domain(ECD) and its interaction with elements of ECM do not influence the meso-scale organization, but may serve to reposition the meshwork with respect to the ECM. Taken together, our results capture the hierarchical nature of CD44 organization at the cell surface, with active cytoskeleton-templated nano-clusters localized to a meso-scale meshwork pattern.

Abstract Crosstalk of cellular signaling pathways is essential for coordinated cell responses. Therefore, we suspect the existence of scaffolding platforms that specifically undertake signal crosstalk and integration. Using advanced single-molecule imaging, we found a nanometer-scale liquid-like platform for integrating the signals downstream from GPI-anchored receptors and receptor-type tyrosine kinases. The platform employs some of the focal adhesion proteins, including integrin, talin, RIAM, VASP, and zyxin, but is distinct from focal adhesions, and is thus termed iTRVZ. The iTRVZ formation is driven by the protein liquid-liquid phase separation and the interactions with the raft domains in the plasma membrane and cortical actin. iTRVZ non-linearly integrates the two distinctly different receptor signals, and thus works as an AND gate and noise filter. One-Sentence Summary Nanometer-scale liquid-like protein platform for signal integration working as an AND gate was found on the plasma membrane.

Abstract Small extracellular vesicles (sEVs) play critical roles in intercellular communication. However, the mechanisms by which sEVs are internalized by recipient cells remain unclear. Here, we investigated these mechanisms through state-of-the-art imaging techniques. Single-molecule imaging revealed that tumor-derived sEVs can be divided into several subtypes. By simultaneously performing single sEV-particle tracking and super-resolution movie observation of membrane invaginations in living cells, we discovered that all sEV subtypes were internalized via phagocytosis, while some subtypes that recruited raft markers were endocytosed via caveolae. Furthermore, we demonstrated that integrin β1 and talin-1 accumulated in recipient cell plasma membranes underneath all sEV subtypes. Paracrine, but not autocrine, sEV binding triggers Ca 2+ mobilization, which is induced by the activation of Src family kinases and PLCγ. Ca 2+ -induced activation of calcineurin-dynamin subsequently promoted sEV internalization, leading to the recycling pathway. Thus, we elucidated the detailed mechanisms of sEV internalization, which is facilitated by paracrine adhesion signaling.

Abstract Summary Quantitative assessments using single-molecule imaging and super-resolution microscopy revealed that all extracellular vesicle subtypes derived from four distinct tumor cell lines, regardless of size, bind to laminin predominantly via CD151-facilitated integrin heterodimers and GM1, but not as much to fibronectin. Tumor-derived extracellular vesicles (EVs) have attracted significant attention, yet the molecular mechanisms that govern their specific binding to recipient cells remain elusive. Our in vitro study utilizing single-particle tracking demonstrated that integrin heterodimers comprising α6β4 and α6β1 are responsible for the binding of small-EV (sEV) subtypes to laminin. EVs derived from four distinct tumor cell lines, regardless of size, exhibited high binding affinities for laminin but not for fibronectin, although fibronectin receptors are abundant in EVs and have functional roles in EV-secreting cells. Our findings also revealed that the robust binding of integrins in EVs to laminin is preserved by CD151 rather than by talin-1 inside-out signaling and is inhibited by a molecule that associates with CD151 via cholesterol. The sEV–laminin interaction is also induced by GM1. Super-resolution movie observation revealed that sEV integrins bind only to laminin on living recipient cells. Thus, we demonstrated that all EV subtypes bind to laminin predominantly via CD151-facilitated integrin heterodimers and GM1.