Phosphorylation is a major post-translation modification (PTM) of proteins which is finely tuned by the activity of several hundred kinases and phosphatases. It controls most if not all cellular pathways including anti-viral responses. Accordingly, viruses often induce important changes in the phosphorylation of host factors that can either promote or counteract viral replication. Among more than 500 kinases constituting the human kinome only few have been described as important for the Hepatitis B virus (HBV) infectious cycle, and most of them intervene during early or late infectious steps by phosphorylating the viral Core protein (HBc) protein. In addition, little is known on the consequences of HBV infection on the activity of cellular kinases. The objective of this study was to investigate the global impact of HBV infection on the cellular phosphorylation landscape early after infection. For this, primary human hepatocytes (PHHs) were challenged or not with HBV, and a mass spectrometry (MS)-based quantitative phosphoproteomic analysis was conducted two- and seven-days post-infection. The results indicated that while, as expected, HBV infection only minimally modified the cell proteome, significant changes were observed in the phosphorylation state of several host proteins at both times points. Gene enrichment and ontology analyses of up- and down- phosphorylated proteins revealed common and distinct signatures induced by infection. In particular, HBV infection resulted in up-phosphorylation of proteins involved in DNA damage signaling and repair, RNA metabolism, in particular splicing, and cytoplasmic cell-signaling. Down-phosphorylated proteins were mostly involved in cell signaling and communication. Validation studies carried out on selected up-phosphorylated proteins, revealed that HBV infection induced a DNA damage response characterized by the appearance of 53BP1 foci, the inactivation of which by siRNA increased cccDNA levels. In addition, among up-phosphorylated RNA binding proteins (RBPs), SRRM2, a major scaffold of nuclear speckles behaved as an antiviral factor. In accordance with these findings, kinase prediction analysis indicated that HBV infection upregulates the activity of major kinases involved in DNA repair. These results strongly suggest that HBV infection triggers an intrinsic anti-viral response involving DNA repair factors and RBPs that contribute to reduce HBV replication in cell culture models.

ABSTRACT The genome of Hepatitis B virus (HBV) persists in infected hepatocytes as a nuclear episome (cccDNA) that is responsible for the transcription of viral genes and viral rebound, following antiviral treatment arrest in chronically infected patients. Beside pegylated interferon-alpha, there is currently no clinically approved therapeutic protocol able to target cccDNA [1]. The development of alternative strategies aiming at permanently abrogating HBV RNA production requires a thorough understanding of cccDNA transcriptional and post-transcriptional regulation. In a previous study, we discovered that 1C8, a compound that inhibits the phosphorylation of some cellular RNA-binding proteins (RBPs), could decrease the level of HBV RNAs. Here, we aimed at identifying kinases responsible for this effect. Among the kinases targeted by 1C8, we focused on DYRK1A, a dual-specificity kinase that controls the transcription of cellular genes by phosphorylating transcription factors, histones, chromatin regulators as well as RNA polymerase II. The results of a combination of genetic and chemical approaches using HBV-infected hepatocytes, indicated that DYRK1A positively regulates the production of HBV RNAs. In addition, we found that DYRK1A associates with cccDNA, and stimulates the production of HBV nascent RNAs. Finally, reporter gene assays showed that DYRK1A up-regulates the activity of the HBV enhancer 1/X promoter in a sequence-dependent manner. Altogether, these results indicate that DYRK1A is a proviral factor that may participate in the the HBV life cycle by stimulating the production of HBx, a viral factor absolutely required to trigger the complete cccDNA transcriptional program.