In response to drought stress the phytohormone ABA (abscisic acid) induces stomatal closure and, therein, activates guard cell anion channels in a calcium-dependent as well as-independent manner. Two key components of the ABA signaling pathway are the protein kinase OST1 (open stomata 1) and the protein phosphatase ABI1 (ABA insensitive 1). The recently identified guard cell anion channel SLAC1 appeared to be the key ion channel in this signaling pathway but remained electrically silent when expressed heterologously. Using split YFP assays, we identified OST1 as an interaction partner of SLAC1 and ABI1. Upon coexpression of SLAC1 with OST1 in Xenopus oocytes, SLAC1-related anion currents appeared similar to those observed in guard cells. Integration of ABI1 into the SLAC1/OST1 complex, however, prevented SLAC1 activation. Our studies demonstrate that SLAC1 represents the slow, deactivating, weak voltage-dependent anion channel of guard cells controlled by phosphorylation/dephosphorylation.

In response to drought stress, the phytohormone abscisic acid (ABA) induces stomatal closure. Thereby the stress hormone activates guard cell anion channels in a calcium-dependent, as well as –independent, manner. O pen st omata 1 protein kinase (OST1) and ABI1 protein phosphatase ( ABA i nsensitive 1 ) represent key components of calcium-independent ABA signaling. Recently, the guard cell anion channel SLAC1 was identified. When expressed heterologously SLAC1 remained electrically silent. Upon coexpression with Ca 2+ -independent OST1, however, SLAC1 anion channels appear activated in an ABI1-dependent manner. Mutants lacking distinct calcium-dependent protein kinases (CPKs) appeared impaired in ABA stimulation of guard cell ion channels, too. To study SLAC1 activation via the calcium-dependent ABA pathway, we studied the SLAC1 response to CPKs in the Xenopus laevis oocyte system. Split YFP-based protein–protein interaction assays, using SLAC1 as the bait, identified guard cell expressed CPK21 and 23 as major interacting partners. Upon coexpression of SLAC1 with CPK21 and 23, anion currents document SLAC1 stimulation by these guard cell protein kinases. Ca 2+ -sensitive activation of SLAC1, however, could be assigned to the CPK21 pathway only because CPK23 turned out to be rather Ca 2+ -insensitive. In line with activation by OST1, CPK activation of the guard cell anion channel was suppressed by ABI1. Thus the CPK and OST1 branch of ABA signal transduction in guard cells seem to converge on the level of SLAC1 under the control of the ABI1/ABA-receptor complex.

Abstract In nature plants are constantly challenged by simultaneous abiotic and biotic stresses, and under conflicting stress scenarios prioritization of stress responses is required for plant survival. Calcium-dependent protein kinase CPK5 is a central hub in local and distal immune signaling, required for hormone salicylic acid (SA)-dependent immunity and pathogen resistance. Here we show that CPK5-dependent immune responses and pathogen resistance are inhibited upon abscisic acid (ABA) treatment or in genetic mutant backgrounds lacking PP2C phosphatase activities including abi1-2 , whereas immune responses are enhanced by co-expression of active ABI1 phosphatase variants. Biochemical studies and mass spectrometry-based phospho-site analysis reveal a direct ABI1 phosphatase-catalyzed de-phosphorylation of CPK5 auto-phosphorylation site T98. Mimicking continuous de-phosphorylation in CPK5 T98A leads to enhanced ROS production and more resistant plants, mimicking the auto-phosphorylated status in CPK5 T98D , reduces CPK5-mediated immune responses. Mechanistic insight identifies differential phosphorylation at T98 in the N-terminal domain of CPK5 to control the level of interaction between the kinase and its substrate protein rather than CPK5 catalytic activity. Thus, CPK5-catalyzed immune signaling may become discontinued even at an elevated cytoplasmic calcium concentration. Our work reveals an elegant mechanism for stress response prioritization in plants: The ABA-dependent phosphatase ABI1, negative regulator of abiotic responses, functions as positive regulator of biotic stress responses, stabilizing CPK5-dependent immune signaling in the absence of ABA. Continuous pathogen survey activates plant immunity in environmentally friendly conditions, whereas under severe abiotic stress the phosphatase/kinase pair prohibits immune signaling through a direct biochemical switch involving two key regulatory enzymes of these antagonistic pathways. Significance Statement Plants challenged by simultaneous abiotic and biotic stresses must prioritize in conflicting scenarios to guarantee survival. Pathogen resistance and immune memory depends on the phytohormone salicylic acid (SA). Adaptation to abiotic stress signaling involves the phytohormone abscisic acid (ABA). We identify a direct biochemical switch by which ABA-mediated abiotic signaling prioritizes over SA-dependent immune responses via reversible phosphorylation at a single protein mark involving two key regulatory enzymes of these antagonistic pathways. Phosphatase ABI1 de-phosphorylates calcium-dependent protein kinase CPK5 at an auto-phosphorylation site T98, which effects the interaction efficiency between the kinase and its substrate. Under abiotic stress ABA mediates phosphatase inhibition, which facilitates prolonged auto-phosphorylation of CPK5, preventing CPK5 substrate interaction and ultimately stop CPK5-mediated immune signaling.

Abstract The cuticle, a hydrophobic layer of cutin and waxes synthesized by plant epidermal cells, is the major barrier to water loss when stomata are closed. Dissecting the genetic architecture of natural variation for maize leaf cuticular conductance ( g c ) is important for identifying genes relevant to improving crop productivity in drought-prone environments. To this end, we performed an integrated genome- and transcriptome-wide association study (GWAS/TWAS) to identify candidate genes putatively regulating variation in leaf g c . Of the 22 plausible candidate genes identified, five were predicted to be involved in cuticle precursor biosynthesis and export, two in cell wall modification, nine in intracellular membrane trafficking, and seven in the regulation of cuticle development. A gene encoding an INCREASED SALT TOLERANCE1-LIKE1 (ISTL1) protein putatively involved in intracellular protein and membrane trafficking was identified in GWAS and TWAS as the strongest candidate causal gene. A set of maize nested near-isogenic lines that harbor the ISTL1 genomic region from eight donor parents were evaluated for g c , confirming the association between g c and ISTL1 in a haplotype-based association analysis. The findings of this study provide novel insights into the role of regulatory variants in the development of the maize leaf cuticle, and will ultimately assist breeders to develop drought-tolerant maize for target environments. Sentence summary We performed an integrated GWAS/TWAS and identified 22 candidate genes putatively regulating variation in maize leaf g c . The association between g c and the strongest candidate causal gene, ISTL1 , was validated with maize nested near-isogenic lines.

The cuticle, a hydrophobic layer of cutin and waxes synthesized by plant epidermal cells, is the major barrier to water loss when stomata are closed at night and under water-limited conditions. Elucidating the genetic architecture of natural variation for leaf cuticular conductance (gc) is important for identifying genes relevant to improving crop productivity in drought-prone environments. To this end, we conducted a genome-wide association study of adult leaves in a maize inbred association panel that was evaluated in four environments (Maricopa, AZ, and San Diego, CA in 2016 and 2017). Five genomic regions significantly associated with gc were resolved to seven plausible candidate genes (ISTL1, two SEC14 homologs, cyclase-associated protein, a CER7 homolog, GDSL lipase, and β-D-XYLOSIDASE 4). These candidates are potentially involved in cuticle biosynthesis, trafficking and deposition of cuticle lipids, cutin polymerization, and cell wall modification. Laser microdissection RNA sequencing revealed that all these candidate genes, with the exception of the CER7 homolog, were expressed in the zone of the expanding adult maize leaf where cuticle maturation occurs. With direct application to genetic improvement, moderately high average predictive abilities were observed for whole-genome prediction of gc in locations (0.46 and 0.45) and across all environments (0.52). The findings of this study provide novel insights into the genetic control of gc and have the potential to help breeders more effectively develop drought-tolerant maize for target environments.

SUMMARY Studying the genetic basis of leaf wax composition and its correlation with leaf cuticular conductance ( g c ) is crucial for improving crop water-use efficiency. The leaf cuticle, which comprises a cutin matrix and various waxes, functions as an extracellular hydrophobic layer, protecting against water loss upon stomatal closure. To address the limited understanding of genes associated with the natural variation of leaf cuticular waxes and their connection to g c , we conducted statistical genetic analyses using leaf transcriptomic, metabolomic, and physiological data sets collected from a maize ( Zea mays L.) panel of ∼300 inbred lines. Through a random forest analysis with 60 cuticular wax traits, it was shown that high molecular weight wax esters play an important role in predicting g c . Integrating results from genome-wide and transcriptome-wide studies (GWAS and TWAS) via a Fisher’s combined test revealed 231 candidate genes detected by all three association tests. Among these, 11 genes exhibit known or predicted roles in cuticle-related processes. Throughout the genome, multiple hotspots consisting of GWAS signals for several traits from one or more wax classes were discovered, identifying four additional plausible candidate genes and providing insights into the genetic basis of correlated wax traits. Establishing a partially shared genetic architecture, we identified 35 genes for both g c and at least one wax trait, with four considered plausible candidates. Our study uncovered the genetic control of maize leaf waxes, establishing a link between wax composition and g c , with implications for potentially breeding more water-use efficient maize. SIGNIFICANCE STATEMENT We exploited natural variation in the abundance of maize leaf cuticular waxes to identify genetic determinants of wax composition and its relationship to cuticle function as a barrier against water loss. We identified a set of strongly supported candidate genes with plausible functions in cuticular wax biosynthesis or deposition and added to the evidence for wax esters as the most important wax for water barrier function, offering new tools for modification of cuticle-dependent traits.

Although extensive prior work has characterized cuticle composition, function, ultrastructure and development in many plant species, much remains to be learned about how these features are interrelated. Moreover, very little is known about the adult maize leaf cuticle in spite of its significance for agronomically important traits in this major crop. We analyzed cuticle composition, ultrastructure, and permeability along the developmental gradient of partially expanded adult maize leaves to probe the relationships between these features. The water barrier property is acquired at the cessation of cell expansion. Wax types and chain lengths accumulate asynchronously along the developmental gradient, while overall wax load does not vary. Cutin begins to accumulate prior to establishment of the water barrier and continues thereafter. Ultrastructurally, pavement cell cuticles consist of an epicuticular layer, a thin cuticle proper that acquires an inner, osmiophilic layer during development, and no cuticular layer. Cuticular waxes of the adult maize leaf are dominated by alkanes and wax esters localized mainly in the epicuticular layer. Establishment of the water barrier coincides with a switch from alkanes to esters as the major wax type, and the emergence of an osmiophilic (likely cutin-rich) layer of the cuticle proper.

The cuticle is a hydrophobic layer on the outer surface plant shoots, which serves as an important interaction interface with the environment. It consists of the lipid polymer cutin, embedded with and covered by waxes, and provides protection against stresses including desiccation, UV radiation, and pathogen attack. Bulliform cells form in longitudinal strips on the adaxial leaf surface, and have been implicated in the leaf rolling response observed in drought stressed grass leaves. In this study, we show that bulliform cells of the adult maize leaf epidermis have a specialized cuticle, and we investigate its function along with that of bulliform cells themselves. Analysis of natural variation was used to relate bulliform strip pattering to leaf rolling rate, providing evidence of a role for bulliform cells in leaf rolling. Bulliform cells displayed increased shrinkage compared to other epidermal cell types during dehydration of the leaf, providing a potential mechanism to facilitate leaf rolling. Comparisons of cuticular conductance between adaxial and abaxial leaf surfaces, and between bulliform-enriched mutants vs. wild type siblings, provided evidence that bulliform cells lose water across the cuticle more rapidly than other epidermal cell types. Bulliform cell cuticles have a distinct ultrastructure, and differences in cutin monomer content and composition, compared to other leaf epidermal cells. We hypothesize that this cell type-specific cuticle is more water permeable than the epidermal pavement cell cuticle, facilitating the function of bulliform cells in stress-induced leaf rolling observed in grasses.

One class of enzymes that plant pathogens employ to manipulate innate immunity and physiology of the infected cells are host-targeted ADP-ribosyltransferases. The bacterial pathogen Pseudomonas syringae uses its type III secretion system to inject several effector proteins with ADP-ribosyltransferase activity into plant cells. One of them, AvrRpm1, ADP-ribosylates the plasma membrane-associated RPM1-INTERACTING PROTEIN 4 (RIN4) in Glycine max and Arabidopsis thaliana to attenuate targeted secretion of defense-promoting compounds. Substrate identification of host-targeted ADP-ribosyltransferases is complicated by the biochemical lability of the protein modification during plant protein extraction and in several cases required prior knowledge on plant immune signaling pathways that are impaired by the ADP-ribosylating type III effector. Using the AvrRpm1-RIN4 pair as a proof-of-concept, we present an untargeted proteomics workflow for enrichment and detection of ADP-ribosylated proteins and peptides from plant cell extracts that in several cases provides site-resolution for the modification.