The structural organization of four microbial communities was analysed by a novel computer program, COMSTAT, which comprises ten features for quantifying three-dimensional biofilm image stacks. Monospecies biofilms of each of the four bacteria, Pseudomonas putida, P. aureofaciens, P. fluorescens and P. aeruginosa, tagged with the green fluorescent protein (GFP) were grown in flow chambers with a defined minimal medium as substrate. Analysis by the COMSTAT program of four variables describing biofilm structure – mean thickness, roughness, substratum coverage and surface to volume ratio – showed that the four Pseudomonas strains represent different modes of biofilm growth. P. putida had a unique developmental pattern starting with single cells on the substratum growing into micro-colonies, which were eventually succeeded by long filaments and elongated cell clusters. P. aeruginosa colonized the entire substratum, and formed flat, uniform biofilms. P. aureofaciens resembled P. aeruginosa, but had a stronger tendency to form micro-colonies. Finally, the biofilm structures of P. fluorescens had a phenotype intermediate between those of P. putida and P. aureofaciens. Analysis of biofilms of P. aureofaciens growing on 0·03 mM, 0·1 mM or 0·5 mM citrate minimal media showed that mean biofilm thickness increased with increasing citrate concentration. Moreover, biofilm roughness increased with lower citrate concentrations, whereas surface to volume ratio increased with higher citrate concentrations.

Summary Pseudomonas aeruginosa produces extracellular DNA which functions as a cell‐to‐cell interconnecting matrix component in biofilms. Comparison of extracellular DNA and chromosomal DNA by the use of polymerase chain reaction and Southern analysis suggested that the extracellular DNA is similar to whole‐genome DNA. Evidence that the extracellular DNA in P. aeruginosa biofilms and cultures is generated via lysis of a subpopulation of the bacteria was obtained through experiments where extracellular β‐galactosidase released from lacZ ‐containing P. aeruginosa strains was assessed. Experiments with the wild type and lasIrhlI , pqsA , pqsL and fliMpilA mutants indicated that the extracellular DNA is generated via a mechanism which is dependent on acyl homoserine lactone and Pseudomonas quinolone signalling, as well as on flagella and type IV pili. Microscopic investigation of flow chamber‐grown wild‐type P. aeruginosa biofilms stained with different DNA stains suggested that the extracellular DNA is located primarily in the stalks of mushroom‐shaped multicellular structures, with a high concentration especially in the outer part of the stalks forming a border between the stalk‐forming bacteria and the cap‐forming bacteria. Biofilms formed by lasIrhlI , pqsA and fliMpilA mutants contained less extracellular DNA than biofilms formed by the wild type, and the mutant biofilms were more susceptible to treatment with sodium dodecyl sulphate than the wild‐type biofilm.

Novel molecular tools have been constructed which allow for in situ detection of N-acyl homoserine lactone (AHL)-mediated quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa biofilms. The reporter responds to AHL activation of LasR by expression of an unstable version of the green-fluorescent protein (Gfp). Gfp-based reporter technology has been applied for non-destructive, single-cell-level detection of quorum sensing in laboratory-based P. aeruginosa biofilms. It is reported that a synthetic halogenated furanone compound, which is a derivative of the secondary metabolites produced by the Australian macroalga Delisea pulchra, is capable of interfering with AHL-mediated quorum sensing in P. aeruginosa. It is demonstrated that the furanone compound specifically represses expression of a PlasB-gfp reporter fusion without affecting growth or protein synthesis. In addition, it reduces the production of important virulence factors, indicating a general effect on target genes of the las quorum sensing circuit. The furanone was applied to P. aeruginosa biofilms established in biofilm flow chambers. The Gfp-based analysis reveals that the compound penetrates microcolonies and blocks cell signalling and quorum sensing in most biofilm cells. The compound did not affect initial attachment to the abiotic substratum. It does, however, affect the architecture of the biofilm and enhances the process of bacterial detachment, leading to a loss of bacterial biomass from the substratum.

ABSTRACT Use of the green fluorescent protein (Gfp) from the jellyfish Aequorea victoria is a powerful method for nondestructive in situ monitoring, since expression of green fluorescence does not require any substrate addition. To expand the use of Gfp as a reporter protein, new variants have been constructed by the addition of short peptide sequences to the C-terminal end of intact Gfp. This rendered the Gfp susceptible to the action of indigenous housekeeping proteases, resulting in protein variants with half-lives ranging from 40 min to a few hours when synthesized in Escherichia coli and Pseudomonas putida . The new Gfp variants should be useful for in situ studies of temporal gene expression.

Summary Biofilm formation by Gfp‐tagged Pseudomonas aeruginosa PAO1 wild type, flagella and type IV pili mutants in flow chambers irrigated with citrate minimal medium was characterized by the use of confocal laser scanning microscopy and comstat image analysis. Flagella and type IV pili were not necessary for P. aeruginosa initial attachment or biofilm formation, but the cell appendages had roles in biofilm development, as wild type, flagella and type IV pili mutants formed biofilms with different structures. Dynamics and selection during biofilm formation were investigated by tagging the wild type and flagella/type IV mutants with Yfp and Cfp and performing time‐lapse confocal laser scanning microscopy in mixed colour biofilms. The initial microcolony formation occurred by clonal growth, after which wild‐type P. aeruginosa bacteria spread over the substratum by means of twitching motility. The wild‐type biofilms were dynamic compositions with extensive motility, competition and selection occurring during development. Bacterial migration prevented the formation of larger microcolonial structures in the wild‐type biofilms. The results are discussed in relation to the current model for P. aeruginosa biofilm development.

Acylated homoserine lactones (AHLs) play a widespread role in intercellular communication among bacteria. The Australian macroalga Delisea pulchra produces secondary metabolites which have structural similarities to AHL molecules. We report here that these metabolites inhibited AHL-controlled processes in prokaryotes. Our results suggest that the interaction between higher organisms and their surface-associated bacteria may be mediated by interference with bacterial regulatory systems.

The stability locus parB+ of plasmid R1 has been found to specify a unique type of plasmid maintenance function. Two genes, hok (host killing) and sok (suppressor of killing), are required for the stabilizing activity. The hok gene encodes a highly toxic gene product, whose overexpression causes a rapid killing and a concomitant dramatic change in morphology of the host cell. The other gene, sok, was found to encode a product that counteracts the hok gene-mediated killing. The parB+ region was inserted in a plasmid with a temperature-sensitive replication system. At nonpermissive temperature, the parB+ plasmid was maintained in the population for a significantly longer period than the corresponding parB- plasmid. Coupled to this extended maintenance, a large fraction of the population was shown to be nonviable plasmid-free cells with the characteristic hok-induced change in morphology. Based on these findings, we propose that the parB+ locus mediates plasmid stability by killing cells that have lost the parB+ plasmid during the preceding cell division, thereby ensuring that a growing bacterial culture predominantly consists of plasmid-containing cells.

ABSTRACT During the course of chronic cystic fibrosis (CF) infections, Pseudomonas aeruginosa undergoes a conversion to a mucoid phenotype, which is characterized by overproduction of the exopolysaccharide alginate. Chronic P. aeruginosa infections involve surface-attached, highly antibiotic-resistant communities of microorganisms organized in biofilms. Although biofilm formation and the conversion to mucoidy are both important aspects of CF pathogenesis, the relationship between them is at the present unclear. In this study, we report that the overproduction of alginate affects biofilm development on an abiotic surface. Biofilms formed by an alginate-overproducing strain exhibit a highly structured architecture and are significantly more resistant to the antibiotic tobramycin than a biofilm formed by an isogenic nonmucoid strain. These results suggest that an important consequence of the conversion to mucoidy is an altered biofilm architecture that shows increasing resistance to antimicrobial treatments.

Summary Detailed knowledge of the developmental process from single cells scattered on a surface to complex multicellular biofilm structures is essential in order to create strategies to control biofilm development. In order to study bacterial migration patterns during Pseudomonas aeruginosa biofilm development, we have performed an investigation with time‐lapse confocal laser scanning microscopy of biofilms formed by various combinations of colour‐coded P. aeruginosa wild type and motility mutants. We show that mushroom‐shaped multicellular structures in P. aeruginosa biofilms can form in a sequential process involving a non‐motile bacterial subpopulation and a migrating bacterial subpopulation. The non‐motile bacteria form the mushroom stalks by growth in certain foci of the biofilm. The migrating bacteria form the mushroom caps by climbing the stalks and aggregating on the tops in a process which is driven by type‐IV pili. These results lead to a new model for biofilm formation by P. aeruginosa .