Abstract Non-obstructive azoospermia (NOA) belongs to male infertility due to spermatogenesis failure. However, evidence for cell type-specific abnormalities of spermatogenesis disorders in NOA remains lacking. We performed single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and single-cell assay for transposase-accessible chromatin sequencing (scATAC-seq) on testicular tissues from patients with obstructive azoospermia(OA) and NOA. HE staining confirmed the structural abnormalities of the seminiferous tubules in NOA patients. We identified 12 germ cell subtypes (spermatogonial stem cell-0 (SSC0), SSC1, SSC2, diffing-spermatogonia (Diffing-SPG), diffed-spermatogonia (Diffed-SPG), pre-leptotene (Pre-Lep), leptotene-zygotene (L-Z), pachytene (Pa), diplotene (Di), spermatids-1 (SPT1), SPT2, and SPT3) and 8 Sertoli cell subtypes (SC1-SC8). Among them, three novel Sertoli cell subtypes phenotypes were identified, namely SC4/immature, SC7/mature, and SC8/further mature Sertoli cells. For each germ or Sertoli cell subtype, we identified unique new markers, among which immunofluorescence confirmed co-localization of ST3GAL4, A2M, ASB9, and TEX19 and DDX4 (classical marker of germ cell). PRAP1, BST2, and CCDC62 were co-expressed with SOX9 (classical marker of Sertoli cell) in testes tissues also confirmed by immunofluorescence. The interaction between germ cell subtypes and Sertoli cell subtypes exhibits stage-specific-matching pattern, as evidenced by SC1/2/5/7 involving in SSC0-2 development, SC3 participating in the whole process of spermiogenesis, SC4/6 participating in Diffing and Diffed-SPG development, and SC8 involving in the final stage of SPT3. This pattern of specific interactions between subtypes of germ cell and Sertoli cell was confirmed by immunofluorescence of novel markers in testes tissues. The interaction was mainly contributed by Notch1/2/3 signaling. Our study profiled the single-cell transcriptome of human spermatogenesis and provided many potentials molecular markers for developing testicular puncture specific marker kits for NOA patients. Impact statement The specific interactions between Sertoli cell subtypes and different stages of germ subgroups maintain normal development of germ cells. SC3 subtype absence may be the key factor leading to NOA.

DNA Mismatch repair (MMR) deficiency is a major cause of hereditary non-polyposis colorectal cancer, and is also associated with increased risk of several other cancers. This is generally ascribed to the role of MMR in avoiding mutations by correcting DNA replication errors. In MMR knockout mice very high frequencies of somatic mutations, up until 100-fold of background, have been reported. However, these results have been obtained using bacterial reporter transgenes, which are not representative for the genome overall, and mutational patterns of MMR deficiency remain largely unknown. To fill this knowledge gap, we performed single-cell whole-genome sequencing of lung fibroblasts of Msh2-/- and wild-type mice. We observed a 4-fold increase of somatic single nucleotide variants (SNVs) in the fibroblasts of Msh2-/- mice compared to those of wild-type mice. The SNV signature of Msh2 deficiency was found to be driven by C>T and T>C transitions. By comparing it to human cancer signatures, we not only confirmed the inferred MMR-deficiency-related etiology of several cancer signatures but also suggested that MMR deficiency is likely the cause of a cancer signature with its etiology previously unknown. We also observed a 7-fold increase of somatic small insertions and deletions (INDELs) in the Msh2-/- mice. An elevated INDEL frequency has also been found in human MMR-related cancers. INDELs and SNVs distributed differently across genomic features in the Msh2-/- and control cells, with evidence of selection pressure and repair preference. These results provide insights into the landscape of somatic mutations in normal somatic cells caused by MMR deficiency.

Abstract The Huntington’s disease mutation is a CAG repeat expansion in the huntingtin gene that results in an expanded polyglutamine tract in the huntingtin protein. The CAG repeat is unstable, and expansions of hundreds of CAGs have been detected in Huntington’s disease post-mortem brains. The age of disease onset can be predicted partially from the length of the CAG repeat as measured in blood. Onset age is also determined by genetic modifiers, which in six cases involve variation in DNA mismatch repair pathways genes. Knocking-out specific mismatch repair genes in mouse models of Huntington’s disease prevents somatic CAG repeat expansion. Taken together, these results have led to the hypothesis that somatic CAG repeat expansion in Huntington’s disease brains is required for pathogenesis. Therefore, the pathogenic repeat threshold in brain is longer than (CAG) 40 , as measured in blood, and is currently unknown. The mismatch repair gene MSH3 has become a major focus for therapeutic development, as unlike other mismatch repair genes, nullizygosity for MSH3 does not cause malignancies associated with mismatch repair deficiency. Potential treatments targeting MSH3 currently under development include gene therapy, biologics and small molecules, which will be assessed for efficacy in mouse models of Huntington’s disease. The zQ175 knock-in model carries a mutation of approximately (CAG) 185 and develops early molecular and pathological phenotypes that have been extensively characterised. Therefore, we crossed the mutant huntingtin allele onto heterozygous and homozygous Msh3 knock-out backgrounds to determine the maximum benefit of targeting Msh3 in this model. Ablation of Msh3 prevented somatic expansion throughout the brain and periphery, and reduction of Msh3 by 50% decreased the rate of expansion. This had no effect on the deposition of huntingtin aggregation in the nuclei of striatal neurons, nor on the dysregulated striatal transcriptional profile. This contrasts with ablating Msh3 in knock-in models with shorter CAG repeat expansions. Therefore, further expansion of a (CAG) 185 repeat in striatal neurons does not accelerate the onset of molecular and neuropathological phenotypes. It is striking that highly expanded CAG repeats of a similar size in humans cause disease onset before 2 years of age, indicating that somatic CAG repeat expansion in the brain is not required for pathogenesis. Given that the trajectory for somatic CAG expansion in the brains of Huntington’s disease mutation carriers is unknown, our study underlines the importance of administering treatments targeting somatic instability as early as possible.

During meiosis, induction of DNA double strand breaks (DSB) leads to recombination between homologous chromosomes, resulting in crossovers (CO) and non-crossovers (NCO). Only 10% DSBs resolve as COs, mostly through a class I pathway dependent on MutS (MSH4/MSH5). Class II CO events represent a minor proportion of the total CO count and also arise from DSBs, but are not thought to involve MutS. However, loading of MutS occurs very early in prophase I at a frequency that far exceeds the final number of class I COs found in late prophase I. Moreover, loss of MutS in mouse results in apoptosis before CO formation, preventing analysis of its CO function. We generated a mutation in the ATP binding domain of Msh5 (Msh5GA). While this mutation was not expected to affect MutS complex formation, MutS foci do not accumulate during prophase I. Nevertheless, while some spermatocytes from Msh5-/- animals progress into pachynema, most spermatocytes from Msh5GA/GA mice progress to late pachynema and beyond. Some spermatocytes from Msh5GA/GA mice complete prophase I entirely, allowing for the first time an assessment of MSH5 function in CO formation. At pachynema, Msh5GA/GA spermatocytes show persistent DSBs, incomplete homolog pairing, and fail to accumulate MutL (MLH1/MLH3). Unexpectedly, Msh5GA/GA diakinesis-staged spermatocytes have no chiasmata at all from any CO pathway, indicating that a functional MutS complex in early prophase I is a pre-requisite for all COs.