Abstract Single-cell DNA sequencing has the potential to reveal detailed hierarchical structures in evolving populations of cells. Single cell approaches are increasingly used to study clonal evolution in human ageing and cancer, but have not yet been deployed to study evolving microbial populations. Here, we present an approach for single bacterial genomic analysis using FACS isolation of individual bacteria followed by whole-genome amplification and sequencing. We apply this to in vitro experimental evolution of a hypermutator strain of Salmonella in response to antibiotic stress (ciprofloxacin). By analysing sequence polymorphisms in individual cells from the population we identified the presence and prevalence of sub-populations which have acquired polymorphisms in genes previously demonstrated to be associated with ciprofloxacin susceptibility. We were also able to identify that the population exposed to antibiotic stress was able to both develop resistance whilst maintaining diversity. This population structure could not be resolved from bulk sequence data, and our results show how high-throughput single-cell sequencing can enhance experimental studies of bacterial evolution.

Most bacteria in nature exist in aggregated communities known as biofilms. Bacteria within biofilms are inherently highly resistant to antibiotics. Current understanding of the evolution and mechanisms of antibiotic resistance is largely derived from work from cells in liquid culture and it is unclear whether biofilms adapt and evolve in response to sub-inhibitory concentrations of drugs. Here we used a biofilm evolution model to show that biofilms of a model food borne pathogen, Salmonella Typhimurium rapidly evolve in response to exposure to three clinically important antibiotics. Whilst the model strongly selected for improved biofilm formation in the absence of any drug, once antibiotics were introduced the need to adapt to the drug was more important than the selection for improved biofilm formation. Adaptation to antibiotic stress imposed a marked cost in biofilm formation, particularly evident for populations exposed to cefotaxime and azithromycin. We identified distinct resistance phenotypes in biofilms compared to corresponding planktonic control cultures and characterised new mechanisms of resistance to cefotaxime and azithromycin. Novel substitutions within the multidrug efflux transporter, AcrB were identified and validated as impacting drug export as well as changes in regulators of this efflux system. There were clear fitness costs identified and associated with different evolutionary trajectories. Our results demonstrate that biofilms adapt rapidly to low concentrations of antibiotics and the mechanisms of adaptation are novel. This work will be a starting point for studies to further examine biofilm specific pathways of adaptation which inform future antibiotic use.

Abstract Enteropathogenic bacteria including Salmonella regularly cause outbreaks of infection from fresh produce posing a significant public health threat. Salmonella ’s ability to persist on fresh produce for extended periods is partly attributed to its capacity to form biofilms, which poses a challenge to food decontamination and facilitates persistence in the food chain. Preventing biofilm formation on food products and in food processing environments is crucial for reducing the incidence of foodborne diseases. Understanding the mechanisms of colonisation and establishment on fresh produce will inform the development of decontamination approaches. We used Transposon-directed Insertion site sequencing (TraDIS- Xpress ) to investigate the mechanisms employed by Salmonella enterica serovar Typhimurium to colonise and establish itself on fresh produce at critical timepoints following infection. We established an alfalfa infection model and compared the findings to those obtained from glass surfaces. Our research revealed dynamic changes in the pathways associated with biofilm formation over time, with distinct plant-specific and glass-specific mechanisms for biofilm formation, alongside the identification of shared genes playing pivotal roles in both contexts. Notably, we observed variations in the significance of factors such as flagella biosynthesis, lipopolysaccharide (LPS) production, and stringent response regulation in biofilm development on plant versus glass surfaces. Understanding the genetic underpinnings of biofilm formation on both biotic and abiotic surfaces offers valuable insights that can inform the development of targeted antibacterial therapeutics, ultimately enhancing food safety throughout the food processing chain. Funding The authors gratefully acknowledge the support of the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC); ERH, JAA, HAK, MAW and ET were supported by the BBSRC Institute Strategic Programme Microbes and Food Safety BB/X011011/1 and its constituent project BBS/E/F/000PR13635. NV was supported by the Food Safety Research Network grant BB/X002985/1 awarded to ET. Data availability Nucleotide sequence data supporting the analysis in this study has been deposited in ArrayExpress under the accession number E-MTAB-13495. The authors confirm all supporting data, code and protocols have been provided within the article or through supplementary data files.

Abstract Food preservatives are crucial in controlling microbial growth in processed foods to maintain food safety. Bacterial biofilms pose a threat in the food chain by facilitating persistence on a range of surfaces and food products. Cells in a biofilm are often highly tolerant of antimicrobials and can evolve in response to antimicrobial exposure. Little is known about the efficacy of preservatives against biofilms and their potential impact on the evolution of antimicrobial resistance. In this study we investigated how the common food pathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium responded to subinhibitory concentrations of four common food preservatives (sodium chloride, potassium chloride, sodium nitrite or sodium lactate) when grown planktonically and in biofilms. We found that each preservative exerted a unique selective pressure on S . Typhimurium populations grown planktonically and in a biofilm. Biofilm formation itself seemed to confer protection when exposed to each of the four preservatives, more so than previous exposure to sub-inhibitory concentrations of preservatives. There was a trade-off between biofilm formation and growth in the presence of three of the four preservatives, where prolonged preservative exposure resulted in reduced biofilm biomass and matrix production over time. Despite the differences in biofilm formation and preservative tolerance seen following three preservative stresses, they selected for mutations in global stress response regulators rpoS and crp . There was no evidence for any selection of cross-resistance to antibiotics after preservative exposure, and some evidence that antagonism between preservatives can be exploited in compound cocktails to reduce contamination in the food chain. Highlights Preservative-specific evolutionary adaptation of Salmonella was shown over time. A trade-off between adaptation and biofilm formation was observed. No cross-resistance to antibiotics was seen after preservative exposure. Mutations were found to be preservative-specific, with some common ones like rpoS and crp .

Hospital acquired infection is a major cause of morbidity and mortality and regimes to prevent infection are crucial in infection control. These include decolonisation of at risk patients of carriage of MRSA which is commonly achieved by protocols that include the use of chlorhexidine, or octenidine as biocidal agents. There is however no standardised single decolonisation regime agreed upon in the UK or other countries and protocols include a variety of active agents. Antibiotic resistant bacteria cause major problems in hospital medicine and concern has been raised regarding the development of biocide resistance which would cause decolonisation regimes to become unreliable. In this study, we assembled a panel of isolates of S. aureus including isolates collected before the development of chlorhexidine and octenidine through to a contemporaneous panel of isolates from a major hospital trust in the UK during a period when the decolonisation regime was altered. We observed significant increases in the MIC and MBC of chlorhexidine in isolates collected from periods of high usage of chlorhexidine. No isolates had a significantly altered MIC or MBC of octenidine apart from those collected after octenidine was introduced into the trust where isolates with four fold decreases in susceptibility emerged. There was no suggestion of cross resistance between the two biocidal agents. A combination of VNTR, PCR for qac genes and whole genome sequencing was used to type isolates and examine possible mechanisms of resistance. The typing data showed no expansion of a single strain was associated with decreased biocide tolerance and isolates with increased chlorhexidine MIC and MBCs were found from different clonal complexes; CC8, CC22 and CC30. Biocide susceptibility did not correlate with carriage of qac efflux pump genes; carriage of qacA and qacB was detected but, with one exception was restricted to isolates of CC8. Analysis of genome sequence data for closely related pairs of strains with differential biocide susceptibility revealed no common mutations or carriage of accessory elements that correlated with biocide tolerance. Mutations with the NorA or NorB efflux pumps, previously associated with chlorhexidine export were identified suggesting this may be an important mechanism of biocide tolerance. The clinical relevance of decreased biocide tolerance in terms of efficacy of decolonisation therapies remains to be established but we present evidence here that isolates are evolving in the face of biocide challenge in patients and that changes to decolonisation regimes are reflected in changes in susceptibility of isolates. More work is needed to assess the impact of these changes to ensure effective and robust decolonisation protocols remain in place.

Abstract The human skin microbiome represents a variety of complex microbial ecosystems that play a key role in host health. Molecular methods to study these communities have been developed but have been largely limited to low-throughput quantification and short amplicon sequencing, providing limited functional information about the communities present. Shotgun metagenomic sequencing has emerged as a preferred method for microbiome studies as it provides more comprehensive information about the species/strains present in a niche and the genes they encode. However, the relatively low bacterial biomass of skin, in comparison to other areas such as the gut microbiome, makes obtaining sufficient DNA for shotgun metagenomic sequencing challenging. Here we describe an optimised high-throughput method for extraction of high molecular weight DNA suitable for shotgun metagenomic sequencing. We validated the performance of the extraction method, and analysis pipeline on skin swabs collected from both adults and babies. The pipeline effectively characterised the bacterial skin microbiota with a cost and throughput suitable for larger longitudinal sets of samples. Application of this method will allow greater insights into community compositions and functional capabilities of the skin microbiome. Impact Statement Determining the functional capabilities of microbial communities within different human microbiomes is important to understand their impacts on health. Extraction of sufficient DNA is challenging, especially from low biomass samples, such as skin swabs suitable for shotgun metagenomics, which is needed for taxonomic resolution and functional information. Here we describe an optimised DNA extraction method that produces enough DNA from skin swabs, suitable for shotgun metagenomics, and demonstrate it can be used to effectively characterise the skin microbiota. This method will allow future studies to identify taxonomic and functional changes in the skin microbiota which is needed to develop interventions to improve and maintain skin health. Data Summary All sequence data and codes can be accessed at: NCBI Bio Project ID: PRJNA937622 DOI: https://github.com/quadram-institute-bioscience/coronahit_guppy DOI: https://github.com/ilianaserghiou/Serghiou-et-al.-2023-Codes

ABSTRACT Pseudomonas aeruginosa is a multidrug-resistant opportunistic human pathogen. Chronic infections are associated with biofilms, conferring resistance to antibiotics and complicating treatment strategies. This study focuses on understanding the role of the uncharacterized gene PA3049 , upregulated under biofilm conditions. In the context of P. aeruginosa biofilms, PA3049 plays a role in withstanding antimicrobial challenges both in vitro and in clinically validated infection models. Under sub-inhibitory concentrations of antibiotic, the deletion of PA3049 resulted in reduced pyocyanin production and altered abundance of enzymes controlling denitrification, pyoverdine, and hydrogen cyanide biosynthesis. Notably, PA3049 directly interacts with two kinases implicated in stress response, inactivating their active sites. Renamed as the B iofilm a ntibiotic tolerance R egulator (BatR), PA3049 is a key player in P. aeruginosa biofilm maintenance and antimicrobial tolerance. These findings contribute to understanding the complex bacterial lifestyle in biofilms, shedding light on a previously uncharacterized gene with significant implications for combating multidrug-resistant infections. IMPORTANCE P. aeruginosa is a multidrug-resistant ESKAPE pathogen that causes chronic biofilm-based infections and is a leading cause of mortality in cystic fibrosis (CF) patients. Understanding the molecular mechanisms underlying P. aeruginosa biofilm resilience and antimicrobial resistance is crucial for developing effective therapeutic interventions. This study focuses on characterizing the gene PA3049 , now known as the b iofilm a ntibiotic tolerance R egulator ( batR ). BatR plays a central role within P. aeruginosa biofilms, orchestrating adaptive responses to antimicrobial challenges. Our work sheds light on the contribution of batR to biofilm biology and its relevance in lung infections, where subinhibitory antibiotic concentrations make BatR pivotal for bacterial survival. By advancing our understanding of P. aeruginosa biofilm regulation, this study holds significant promise for the development of innovative approaches against biofilm-associated infections to mitigate the growing threat of antimicrobial resistance.

Abstract For antibiotics with intracellular targets, effective treatment of bacterial infections requires the drug to accumulate to a high concentration inside cells. Bacteria produce a complex cell envelope and possess drug-export efflux pumps to limit drug accumulation inside cells. Decreasing cell envelope permeability and increasing efflux pump activity can reduce intracellular accumulation of antibiotics, and are commonly seen in antibiotic resistant strains. Here, we show that the balance between influx and efflux differs depending on bacterial growth phase in Gramnegative bacteria. Accumulation of the model fluorescent drug, ethidium bromide (EtBr) was measured in S . Typhimurium SL1344 (wild-type) and efflux deficient (Δ acrB ) strains during growth. In SL1344, EtBr accumulation remained low, regardless of growth phase and did not correlate with acrAB transcription. EtBr accumulation in Δ acrB was high in exponential phase but dropped sharply later in growth, with no significant difference to SL1344 in stationary phase. Low EtBr accumulation in stationary phase was not due to the upregulation of other efflux pumps, but instead, due to decreased permeability of the envelope in stationary phase. RNAseq identified changes in expression of several pathways that remodel the envelope in stationary phase, leading to lower permeability. This study shows that efflux is only important for maintaining low drug accumulation in actively growing cells, and that envelope permeability is the predominant factor dictating the rate of drug entry in stationary phase cells. This conclusion means that (i) antibiotics with intracellular targets may be less effective in complex non-growing or slow-growing bacterial infections where intracellular accumulation may be low, (ii) efflux inhibitors may be successful in potentiating the activity of existing antibiotics, but potentially only for bacterial infections where cells are actively growing and (iii) the remodelling of the cell envelope prior to stationary phase could provide novel drug targets.