ABSTRACT Hypomethylating agents (HMAs) are frontline therapies effective at altering the natural course of Myelodysplastic Neoplasms (MDS) and Acute Myeloid Leukemia (AML). However, acquired resistance and treatment failure are hallmarks of HMA therapy. To address this clinical need, we performed a genome-wide CRISPR-Cas9 screen in a human MDS-derived cell line, MDS-L, and identified TOPORS as a highly ranked loss-of-function target that synergizes with HMAs, reducing leukemic burden and improving survival in xenograft models. We demonstrate that the depletion of TOPORS mediates sensitivity to HMAs by predisposing leukemic blasts to an impaired DNA damage response (DDR) accompanied by an accumulation of SUMOylated DNMT1 in HMA-treated TOPORS-depleted cells. Importantly, the combination of HMAs with targeting of TOPORS did not functionally impair healthy hematopoiesis. While inhibitors of TOPORS are currently unavailable, we show that inhibition of protein SUMOylation (upstream of TOPORS functions) with TAK-981 partially phenocopies HMA-sensitivity and DDR impairment. Overall, our data suggest that the combination of HMAs with the inhibition of SUMOylation or TOPORS demonstrates a favourable therapeutic index and is a rational treatment framework for High-Risk MDS (HR-MDS) or AML.

ABSTRACT Progressively acquired somatic mutations in hematopoietic stem cells are central to pathogenesis in myelodysplastic syndromes (MDS) and chronic myelomonocytic leukemia (CMML). They can lead to proliferative advantages, impaired differentiation and progressive cytopenias. MDS or CMML patients with high-risk disease are treated with hypomethylating agents including 5-azacytidine (AZA). Clinical improvement does not require eradication of mutated cells and may be related to improved differentiation capacity of mutated hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). However, the contribution of mutated HSPCs to steadystate hematopoiesis in MDS and CMML is unclear. To address this, we characterised the somatic mutations of individual stem, progenitor (common myeloid progenitor, granulocyte monocyte progenitor, megakaryocyte erythroid progenitor), and matched circulating (monocyte, neutrophil, naïve B cell) haematopoietic cells in treatment naïve and AZA-treated MDS and CMML via high-throughput single cell genotyping. The mutational burden was similar across multiple hematopoietic cell types, and even the most mutated stem and progenitor clones maintained their capacity to differentiate to mature myeloid and, in some cases, lymphoid cell types in vivo. Our data show that even highly mutated HSPCs contribute significantly to circulating blood cells in MDS and CMML, prior to and following AZA treatment. Key points * Highly mutated HSPCs contribute significantly to circulating blood cells in MDS and CMML, prior to and following AZA treatment. * The mutational burden in matched bone marrow and peripheral blood cells in MDS and CMML was similar throughout myelopoiesis.