Interactions of tumor cells with lymphatic vessels are of paramount importance for tumor progression, however, the underlying molecular mechanisms are poorly understood. Whereas enlarged lymphatic vessels are frequently observed at the periphery of malignant melanomas, it has remained unclear whether intratumoral lymphangiogenesis occurs within these tumors. Here, we demonstrate the presence of intratumoral lymphatics and enlargement of lymphatic vessels at the tumor periphery in vascular endothelial growth factor (VEGF)-C-overexpressing human melanomas transplanted onto nude mice. VEGF-C expression also resulted in enhanced tumor angiogenesis, indicating a coordinated regulation of lymphangiogenesis and angiogenesis in melanoma progression. The specific biological effects of VEGF-C were critically dependent on its proteolytic processing in vivo. Furthermore, VEGF-C induced chemotaxis of macrophages in vitro and in vivo, revealing a potential function of VEGF-C as an immunomodulator. Taken together, our results identify VEGF-C as multifunctional factor involved in regulating tumor lymphangiogenesis, angiogenesis, and immune response. Interactions of tumor cells with lymphatic vessels are of paramount importance for tumor progression, however, the underlying molecular mechanisms are poorly understood. Whereas enlarged lymphatic vessels are frequently observed at the periphery of malignant melanomas, it has remained unclear whether intratumoral lymphangiogenesis occurs within these tumors. Here, we demonstrate the presence of intratumoral lymphatics and enlargement of lymphatic vessels at the tumor periphery in vascular endothelial growth factor (VEGF)-C-overexpressing human melanomas transplanted onto nude mice. VEGF-C expression also resulted in enhanced tumor angiogenesis, indicating a coordinated regulation of lymphangiogenesis and angiogenesis in melanoma progression. The specific biological effects of VEGF-C were critically dependent on its proteolytic processing in vivo. Furthermore, VEGF-C induced chemotaxis of macrophages in vitro and in vivo, revealing a potential function of VEGF-C as an immunomodulator. Taken together, our results identify VEGF-C as multifunctional factor involved in regulating tumor lymphangiogenesis, angiogenesis, and immune response. The spread of tumor cells via lymphatic vessels to the regional lymph nodes is one of the most important indicators of tumor aggressiveness, and the extent of lymph node involvement is a major determinant for the staging and the prognosis of most human malignancies.1Witte MH Way DL Witte CL Bernas M Lymphangiogenesis: mechanisms, significance and clinical implications.Exs. 1997; 79: 65-112PubMed Google Scholar, 2Lauria R Perrone F Carlomagno C De Laurentiis M Morabito A Gallo C Varriale E Pettinato G Panico L Petrella G Bianco AR De Placido S The prognostic value of lymphatic and blood vessel invasion in operable breast cancer.Cancer. 1995; 76: 1772-1778Crossref PubMed Scopus (156) Google Scholar, 3Willis RA The Spread of Tumors in the Human Body. C. V. Mosby Co., St. Louis1952: 18-35Google Scholar Abundant, rearranged, and often dilated lymphatic vessels containing clusters of tumor cells are commonly observed at the periphery of many tumors, including malignant melanomas.1Witte MH Way DL Witte CL Bernas M Lymphangiogenesis: mechanisms, significance and clinical implications.Exs. 1997; 79: 65-112PubMed Google Scholar, 4Hartveit E Attenuated cells in breast stroma: the missing lymphatic system of the breast.Histopathology. 1990; 16: 533-543Crossref PubMed Scopus (65) Google Scholar, 5Cann SA van Netten JP Ashby TL Ashwood-Smith MJ van der Westhuizen NG Role of lymphagenesis in neovascularisation.Lancet. 1995; 346: 903Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (10) Google Scholar, 6Deutsch A Lubach D Nissen S Neukam D Ultrastructural studies on the invasion of melanomas in initial lymphatics of human skin.J Invest Dermatol. 1992; 98: 64-67Crossref PubMed Scopus (13) Google Scholar, 7Jussila L Valtola R Partanen TA Salven P Heikkila P Matikainen MT Renkonen R Kaipainen A Detmar M Tschachler E Alitalo R Alitalo K Lymphatic endothelium and Kaposi's sarcoma spindle cells detected by antibodies against the vascular endothelial growth factor receptor-3.Cancer Res. 1998; 58: 1599-1604PubMed Google Scholar However, the presence of lymphatic vessels within tumors and the ability of tumor cells to induce lymphangiogenesis have remained controversial.8Folkman J Angiogenesis and tumor growth.N Engl J Med. 1996; 334: 921Google Scholar, 9Leu AJ Berk DA Lymboussaki A Alitalo K Jain RK Absence of functional lymphatics within a murine sarcoma: a molecular and functional evaluation.Cancer Res. 2000; 60: 4324-4327PubMed Google Scholar Whereas tumor angiogenesis involving the formation of new blood vessels has been studied extensively, the role of lymphatic vessels in tumor pathology and the molecules regulating lymphangiogenesis have remained mostly unknown. Recently, a novel member of the vascular endothelial growth factor (VEGF) family has been identified that is distinguished by its capacity to stimulate lymphangiogenesis.10Joukov V Pajusola K Kaipainen A Chilov D Lahtinen I Kukk E Saksela O Kalkkinen N Alitalo K A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases.EMBO J. 1996; 15: 290-298Crossref PubMed Scopus (1177) Google Scholar, 11Lee J Gray A Yuan J Luoh SM Avraham H Wood WI Vascular endothelial growth factor-related protein: a ligand and specific activator of the tyrosine kinase receptor Flt4.Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 1988-1992Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar Vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) stimulated lymphangiogenesis in the avian chorioallantoic membrane assay,12Oh SJ Jeltsch MM Birkenhager R McCarthy JE Weich HA Christ B Alitalo K Wilting J VEGF and VEGF-C: specific induction of angiogenesis and lymphangiogenesis in the differentiated avian chorioallantoic membrane.Dev Biol. 1997; 188: 96-109Crossref PubMed Scopus (436) Google Scholar and transgenic mice overexpressing VEGF-C in the skin were characterized by specific hyperplasia of the lymphatic network without obvious effects on blood vessels.13Jeltsch M Kaipainen A Joukov V Kukk E Lymbousssaki AXM Lakso M Alitalo K Hyperplasia of lymphatic vessels in VEGF-C transgenic mice.Science. 1997; 276: 1423-1425Crossref PubMed Scopus (1124) Google Scholar In normal adult human tissues, the VEGF-C receptor VEGFR-3 (Flt-4) has been found predominantly expressed by lymphatic endothelium.7Jussila L Valtola R Partanen TA Salven P Heikkila P Matikainen MT Renkonen R Kaipainen A Detmar M Tschachler E Alitalo R Alitalo K Lymphatic endothelium and Kaposi's sarcoma spindle cells detected by antibodies against the vascular endothelial growth factor receptor-3.Cancer Res. 1998; 58: 1599-1604PubMed Google Scholar, 14Kaipainen A Korhonen J Mustonen T van HV Fang GH Dumont D Breitman M Alitalo K Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development.Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92: 3566-3570Crossref PubMed Scopus (1203) Google Scholar However, VEGF-C also binds VEGFR-2 (KDR), that is mainly expressed by activated endothelium of blood vessels, suggesting a potential function of VEGF-C in the induction of angiogenesis.10Joukov V Pajusola K Kaipainen A Chilov D Lahtinen I Kukk E Saksela O Kalkkinen N Alitalo K A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases.EMBO J. 1996; 15: 290-298Crossref PubMed Scopus (1177) Google Scholar, 15Neufeld G Cohen T Gengrinovitch S Poltorak Z Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors.FASEB J. 1999; 13: 9-22Crossref PubMed Scopus (3184) Google Scholar Indeed, VEGF-C stimulates the proliferation and migration of blood vascular endothelial cells in vitro and has been shown to increase vascular permeability in the Miles assay,10Joukov V Pajusola K Kaipainen A Chilov D Lahtinen I Kukk E Saksela O Kalkkinen N Alitalo K A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases.EMBO J. 1996; 15: 290-298Crossref PubMed Scopus (1177) Google Scholar, 11Lee J Gray A Yuan J Luoh SM Avraham H Wood WI Vascular endothelial growth factor-related protein: a ligand and specific activator of the tyrosine kinase receptor Flt4.Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 1988-1992Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar, 16Joukov V Sorsa T Kumar V Jeltsch M Claesson WL Cao Y Saksela O Kalkkinen N Alitalo K Proteolytic processing regulates receptor specificity and activity of VEGF-C.EMBO J. 1997; 16: 3898-3911Crossref PubMed Scopus (655) Google Scholar, 17Skobe M Brown LF Tognazzi K Ganju RK Dezube BJ Alitalo K Detmar M Vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) and its receptors KDR and flt-4 are expressed in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.J Invest Dermatol. 1999; 113: 1047-1053Crossref PubMed Scopus (109) Google Scholar and to induce angiogenesis in the mouse corneal micropocket assay and in the rabbit ischemic hind limb model.18Cao Y Linden P Farnebo J Cao R Eriksson A Kumar V Qi JH Claesson-Welsh L Alitalo K Vascular endothelial growth factor C induces angiogenesis in vivo.Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95: 14389-14394Crossref PubMed Scopus (503) Google Scholar, 19Witzenbichler B Asahara T Murohara T Silver M Spyridopoulos I Magner M Principe N Kearney M Hu JS Isner JM Vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C/VEGF-2) promotes angiogenesis in the setting of tissue ischemia.Am J Pathol. 1998; 153: 381-394Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (312) Google Scholar VEGF-C mRNA expression has been demonstrated in a large number of human tumors, including malignant melanomas.20Salven P Lymboussaki A Heikkila P Jaaskela-Saari H Enholm B Aase K von Euler G Eriksson U Alitalo K Joensuu H Vascular endothelial growth factors VEGF-B and VEGF-C are expressed in human tumors.Am J Pathol. 1998; 153: 103-108Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (295) Google Scholar, 21Valtola R Salven P Heikkila P Taipale J Joensuu H Rehn M Pihlajaniemi T Weich H deWaal R Alitalo K VEGFR-3 and its ligand VEGF-C are associated with angiogenesis in breast cancer.Am J Pathol. 1999; 154: 1381-1390Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (491) Google Scholar, 22Kurebayashi J Otsuki T Kunisue H Mikami Y Tanaka K Yamamoto S Sonoo H Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) family members in breast cancer.Jpn J Cancer Res. 1999; 90: 977-981Crossref PubMed Scopus (158) Google Scholar, 23Andre T Kotelevets L Vaillant JC Coudray AM Weber L Prevot S Parc R Gespach C Chastre E Vegf, Vegf-B, Vegf-C and their receptors KDR, FLT-1 and FLT-4 during the neoplastic progression of human colonic mucosa.Int J Cancer. 2000; 86: 174-181Crossref PubMed Scopus (144) Google Scholar, 24Akagi K Ikeda Y Miyazaki M Abe T Kinoshita J Maehara Y Sugimachi K Vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) expression in human colorectal cancer tissues.Br J Cancer. 2000; 83: 887-891Crossref PubMed Scopus (222) Google Scholar, 25Niki T Iba S Tokunou M Yamada T Matsuno Y Hirohashi S Expression of vascular endothelial growth factors A, B, C, and D and their relationships to lymph node status in lung adenocarcinoma.Clin Cancer Res. 2000; 6: 2431-2439PubMed Google Scholar, 26Ohta Y Nozawa H Tanaka Y Oda M Watanabe Y Increased vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor-c and decreased nm23 expression associated with microdissemination in the lymph nodes in stage I non-small cell lung cancer.J Thorac Cardiovasc Surg. 2000; 119: 804-813Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (108) Google Scholar, 27Shushanov S Bronstein M Adelaide J Jussila L Tchipysheva T Jacquemier J Stavrovskaya A Birnbaum D Karamysheva A VEGF-C and VEGFR3 expression in human thyroid pathologies.Int J Cancer. 2000; 86: 47-52Crossref PubMed Scopus (43) Google Scholar, 28Bunone G Vigneri P Mariani L Buto S Collini P Pilotti S Pierotti MA Bongarzone I Expression of angiogenesis stimulators and inhibitors in human thyroid tumors and correlation with clinical pathological features.Am J Pathol. 1999; 155: l967-1976Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (353) Google Scholar, 29Fellmer PT Sato K Tanaka R Okamoto T Kato Y Kobayashi M Shibuya M Obara T Vascular endothelial growth factor-C gene expression in papillary and follicular thyroid carcinomas.Surgery. 1999; 126: 1056-1061Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (71) Google Scholar, 30Yonemura Y Endo Y Fujita H Fushida S Ninomiya I Bandou E Taniguchi K Miwa K Ohoyama S Sugiyama K Sasaki T Role of vascular endothelial growth factor C expression in the development of lymph node metastasis in gastric cancer.Clin Cancer Res. 1999; 5: 1823-1829PubMed Google Scholar, 31Ohta Y Shridhar V Bright RK Kalemkerian GP Du W Carbone M Watanabe Y Pass HI VEGF and VEGF type C play an important role in angiogenesis and lymphangiogenesis in human malignant mesothelioma tumours.Br J Cancer. 1999; 81: 54-61Crossref PubMed Scopus (314) Google Scholar, 32Eggert A Ikegaki N Kwiatkowski J Zhao H Brodeur GM Himelstein BP High-level expression of angiogenic factors is associated with advanced tumor stage in human neuroblastomas.Clin Cancer Res. 2000; 6: 1900-1908PubMed Google Scholar Expression of its receptor VEGFR-3 has been detected in lymphatic vessels and occasionally also in blood vessels adjacent to cancer cells.7Jussila L Valtola R Partanen TA Salven P Heikkila P Matikainen MT Renkonen R Kaipainen A Detmar M Tschachler E Alitalo R Alitalo K Lymphatic endothelium and Kaposi's sarcoma spindle cells detected by antibodies against the vascular endothelial growth factor receptor-3.Cancer Res. 1998; 58: 1599-1604PubMed Google Scholar, 14Kaipainen A Korhonen J Mustonen T van HV Fang GH Dumont D Breitman M Alitalo K Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development.Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92: 3566-3570Crossref PubMed Scopus (1203) Google Scholar, 21Valtola R Salven P Heikkila P Taipale J Joensuu H Rehn M Pihlajaniemi T Weich H deWaal R Alitalo K VEGFR-3 and its ligand VEGF-C are associated with angiogenesis in breast cancer.Am J Pathol. 1999; 154: 1381-1390Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (491) Google Scholar Most recently, we have shown that VEGF-C overexpression in experimental breast cancer selectively induced intratumoral lymphangiogenesis, leading to increased tumor metastasis, without obvious effects on angiogenesis.33Skobe M Hawighorst T Jackson DG Prevo R Janes L Velasco P Riccardi L Alitalo K Claffey K Detmar M Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis.Nat Med. 2001; 7: 192-198Crossref PubMed Scopus (1522) Google Scholar In the present study we demonstrate the occurrence of intratumoral lymphangiogenesis in VEGF-C-overexpressing human melanomas transplanted onto nude mice. Moreover, VEGF-C also induced tumor angiogenesis and recruitment of macrophages. Our results indicate that the distinct biological effects of VEGF-C are critically dependent on its proteolytic processing in vivo. The human malignant melanoma cell lines MeWo,34Sordat BCM Ueyama Y Fogh J The Nude Mouse in Experimental and Clinical Research.in: Fogh J Giovanella BC Academic Press, New York1982: 95-147Google Scholar, 35Kerbel RS Man MS Dexter D A model of human cancer metastasis: extensive spontaneous and artificial metastasis of a human pigmented melanoma and derived variant sublines in nude mice.J Natl Cancer Inst. 1984; 72: 93-108Crossref PubMed Scopus (92) Google Scholar WM9, and WM239 were provided by Dr. Robert S. Kerbel (Sunnybrook Health Science Center, Toronto, Canada). Human melanoma cell lines PM-WK, RPM-MC, RPM-EP, and MM-LH36Byers HR Etoh T Lee KW Mihm MJ Gattoni CS Organ-specific metastases in immunodeficient mice injected with human melanoma cells: a quantitative pathological analysis.Melanoma Res. 1993; 3: 247-253Crossref PubMed Google Scholar were obtained from Dr. Randy Byers (Boston University Medical School, Boston, MA). The human melanoma cell lines SK-MEL-5, SK-MEL-25, SK-MEL-28, MelJuso, Colo 38, MML-1, HS695T, and MELKL-2 were obtained from the tumor bank of the German Cancer Research Center in Heidelberg, Germany. All melanoma cell lines were maintained in RPMI 1640 medium with 5% fetal bovine serum; human prostatic adenocarcinoma PC-3 cells (American Type Culture Collection, Rockville, MD) in Ham's F12 medium with 5% fetal bovine serum. All media were purchased from Life Technologies, Inc., Grand Island, NY. A human VEGF-C cDNA comprising the complete coding sequence (GenBank accession number X94216)10Joukov V Pajusola K Kaipainen A Chilov D Lahtinen I Kukk E Saksela O Kalkkinen N Alitalo K A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases.EMBO J. 1996; 15: 290-298Crossref PubMed Scopus (1177) Google Scholar was cloned into a pcDNA3.1/Zeo expression vector (Invitrogen, San Diego, CA) that contains a CMV-enhancer promoter and a Zeocin selection cassette. The sequence and the orientation of the VEGF-C gene in the construct were verified by restriction mapping and direct sequencing. Human MeWo malignant melanoma cells were transfected either with the human VEGF-C cDNA cloned into a pcDNA3.1/Zeo vector or with the vector alone using the Superfect transfection reagent (Qiagen, Chatsworth, CA). Transfected cells were selected and maintained in growth medium containing 50 μg/ml Zeocin. Stably transfected cell clones were individually expanded and analyzed for VEGF-C mRNA expression and protein secretion. Total cellular RNA was isolated from cultured cells and from tumors using the RNeasy kit (Qiagen). The isolated RNA was subjected to electrophoresis (15 μg per lane) and transferred to Hybond-N+ membranes (Amersham, Arlington Heights, IL). 32P-radiolabeled DNA probes were labeled by the random priming method (Multiprime labeling kit; Amersham, Arlington Heights, IL). The VEGF-C probe used was a fragment containing nucleotides 581 to 1634 of human VEGF-C cDNA. The probe for human VEGF hybridizes with a region of VEGF mRNA common to all known VEGF splice variants.37Berse B Brown LF Van De Water L Dvorak HF Senger DR Vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) gene is expressed differentially in normal tissues, macrophages, and tumors.Mol Biol Cell. 1992; 3: 211-220Crossref PubMed Scopus (866) Google Scholar A human β-actin cDNA probe (Clontech, Palo Alto, CA) was used as a control for equal RNA loading. Blots were hybridized at 65°C for 24 hours, washed at high stringency, and exposed to X-OMAT MR film (Kodak, Rochester, NY). Cells grown to 80% confluency were lysed with Izuhara buffer (50 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 30 mmol/L Na-pyrophosphate, 50 mmol/L Na-fluoride, 1 mmol/L Na-orthovanadate, pH 7.4) containing protease inhibitors (phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.02 mol/L; leupeptin, 50 μg/ml; aprotinin, 50 μg/ml). The amount of protein was determined with the BioRad protein assay (BioRad, Hercules, CA), and 15 μg were analyzed on the gel. Conditioned media were obtained from subconfluent cells grown for 60 hours in serum-free media, concentrated 100-fold using Centricon-10 columns (Amicon, Beverly, MA), and 15 μg of protein were loaded on the gel. Tumors were snap-frozen in liquid nitrogen, lysed by homogenizing the tissue (0.5 g) in 2 ml of a buffer containing 2% sodium dodecyl sulfate, 50 mmol/L Tris (pH 7.4), and protease inhibitors as above, and 10 μl were loaded onto the gel. All samples were boiled in denaturing Laemmli sample buffer (BioRad), analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, and blotted onto polyvinylidene difluoride membranes (BioRad). Filters were blocked overnight with 5% nonfat milk in phosphate-buffered saline (PBS)/0.1% Tween 20 and were incubated with a rabbit antiserum against human VEGF-C (1:1000).16Joukov V Sorsa T Kumar V Jeltsch M Claesson WL Cao Y Saksela O Kalkkinen N Alitalo K Proteolytic processing regulates receptor specificity and activity of VEGF-C.EMBO J. 1997; 16: 3898-3911Crossref PubMed Scopus (655) Google Scholar After washes, membranes were incubated with horseradish-peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG (1:2000; Amersham), washed, and analyzed using the Amersham ECL+ chemiluminescence reagents. Receptor phosphorylation assays were performed as described,33Skobe M Hawighorst T Jackson DG Prevo R Janes L Velasco P Riccardi L Alitalo K Claffey K Detmar M Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis.Nat Med. 2001; 7: 192-198Crossref PubMed Scopus (1522) Google Scholar using antibodies against mouse VEGFR-2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) and phosphotyrosine (PY-20; ICN Biomedicals, Aurora, Ohio). Stably transfected MeWo cells (2 × 106 in 100 μl of serum-free culture medium) were injected intradermally on each side of the back of 8-week-old female Swiss/c (nu/nu) nude mice (five mice for each clone). Three clones were analyzed for each construct. Tumor growth was measured weekly using a digital caliper. Tumors were harvested when they reached a size of >1200 mm3 or after 6 to 8 weeks, and were embedded in OCT compound and frozen in liquid nitrogen or were fixed in 4% paraformaldehyde/PBS and processed for routine histology. For RNA or protein extractions, tumors were snap-frozen in liquid nitrogen. Two independent experiments with five mice in each group were performed. The 19-amino acid synthetic peptide CYPGKQAERAKWVPERRSQ, corresponding to amino acid residues 265 to 285 in the Ig-like domain 3 of the mouse VEGFR-3 extracellular domain, was used to immunize rabbits with standard techniques. The antisera were affinity purified and specific staining of lymphatic vessels was confirmed in adult mouse tissues (heart, lung, spleen, and liver). Cryosections were stained as previously described,38Skobe M Rockwell P Goldstein N Vosseler S Fusenig NE Halting angiogenesis suppresses carcinoma cell invasion.Nat Med. 1997; 3: 1222-1227Crossref PubMed Scopus (411) Google Scholar using antibodies against mouse CD31 (dilution 1/30; Pharmingen, San Diego, CA), LYVE-1 (1/300),33Skobe M Hawighorst T Jackson DG Prevo R Janes L Velasco P Riccardi L Alitalo K Claffey K Detmar M Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis.Nat Med. 2001; 7: 192-198Crossref PubMed Scopus (1522) Google Scholar, 39Prevo R Banerji S Ferguson DJ Clasper S Jackson DG Mouse LYVE-1 is an endocytic receptor for hyaluronan in lymphatic endothelium.J Biol Chem. 2001; 276: 19420-19430Crossref PubMed Scopus (418) Google Scholar VEGFR-3 (1/50; rabbit polyclonal; 1/30; R&D Systems, Minneapolis, MN), CD11b/Mac-1 (1/200; Pharmingen), or F4/80 (1/200; Serotec, Raleigh, NC). The secondary antibodies, labeled with either Texas Red or fluorescein isothiocyanate (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) were used at the dilution 1/50. Cell nuclei were counterstained with Hoechst bisbenzimide (Sigma, St. Louis, MO) at 20 μg/ml. Specimens were examined by using a Nikon E-600 microscope (Nikon, Melville, NY). For analysis of tumor vascularization, immunohistochemical stainings were performed on 6-μm frozen sections of tumor xenografts using an antibody against mouse CD31.40Detmar M Brown LF Schön MP Elicker BM Velasco P Richard L Fukumura D Monsky W Claffey KP Jain RK Increased microvascular density and enhanced leukocyte rolling and adhesion in the skin of VEGF transgenic mice.J Invest Dermatol. 1998; 111: 1-6Crossref PubMed Scopus (467) Google Scholar Tissue sections were viewed using a Nikon E-600 microscope and images were captured with a SPOT digital camera (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI). Two MeWo/control and two MeWo/VEGF-C clones were analyzed, five tumors each. On each tumor section, three randomly chosen fields were evaluated at ×60 magnification. Morphometric analysis was performed using the IPLab software (Scanalytics, Fairfax, VA) to determine vessel density, size distribution, and the relative tumor area covered by vessels.33Skobe M Hawighorst T Jackson DG Prevo R Janes L Velasco P Riccardi L Alitalo K Claffey K Detmar M Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis.Nat Med. 2001; 7: 192-198Crossref PubMed Scopus (1522) Google Scholar For analysis of macrophage densities, sections were stained with CD11b/Mac-1 antibody as described above. Three MeWo/control and three MeWo/VEGF-C clones were analyzed, three tumors each. For each tumor, the total area of the adjacent overlying skin was analyzed, and the relative area of the skin occupied by macrophages was determined using the IPLab software. The unpaired t-test was used for statistical analysis. Computed tomography was performed to determine the clearance rate of a lymphographic contrast agent from the tumors. Mice were imaged 5 weeks after tumor cell inoculation. Mice bearing MeWo/control tumors were additionally analyzed when the tumor size equaled that of the MeWo/VEGF-C tumors at 5 weeks (∼1000 mm3). Three mice carrying two tumors each were analyzed in both groups. After anesthesia with a mixture of ketamine (100 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg), mice were injected with an iodinated lymphographic contrast agent,41Wolf GL Shore MT Bessin G McIntire GL Bacon ER Illig KJ Lymph node extraction of radiopaque nanoparticulates in the rabbit as measured in vivo with CT.Acad Radiol. 1999; 6: 55-60Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (12) Google Scholar and imaging was performed by using a helical computed tomography scanner (TCT900S/xII; Toshiba, Tokyo, Japan). The contrast agent was administered very slowly by injection into the center of each tumor (20 μl per tumor) by using a 30-gauge needle attached to a Hamilton syringe. Mice were imaged before, immediately after, 6 hours, 24 hours, 48 hours, and 72 hours after the injection of the contrast agent. Each imaging study consisted of a helical data acquisition through the tumor and the axillary region for the assessment of axillary lymph nodes. The imaging parameters were 120-kV tube voltage, 150-mA tube current, 2-mm slice thickness, and a high-resolution imaging mode with an 80-mm field of view. Images were reconstructed onto a 512 × 512 image matrix yielding 0.05 mm3 voxels. Data analysis was performed with the image analysis program DIP Station (HIPG, Boulder, CO) to obtain the average signal intensity value for the tumor volume. Signal intensity values in computed tomography are expressed as Hounsfield units that change linearly as a function of contrast agent concentration in the tissue.42Groothuis DR Lapin GD Vriesendorp FJ Mikhael MA Patlak CS A method to quantitatively measure transcapillary transport of iodinated compounds in canine brain tumors with computed tomography.J Cereb Blood Flow Metab. 1991; 11: 939-948Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar A signal-time curve was created for each tumor and the rate constant was calculated using a mono-exponential model as a first approximation. The average clearance rate was then calculated for each group of animals. Macrophage accumulation was induced in Swiss/c nu/nu mice by intraperitoneal injection of 1 ml of 3% Brewer thioglycollate medium and macrophages were harvested 5 days after injection by lavage with Hanks’ balanced salt solution.43Edelson PJ Cohn ZA In Vitro Methods in Cell Mediated Tumor Immunity 1. Academic Press, New York1976: 333-340Google Scholar For flow cytometry, macrophages were detached from the tissue culture dish by scraping, incubated for 15 minutes at 4°C with antibodies to CD11b or mouse VEGFR-3 and with fluorescein isothiocyanate-labeled corresponding secondary antibodies. Chemotaxis was examined using 24-well Transwell migration chambers (8 μm pore size; Costar). Inserts were coated on the underside with 10 μg/ml of collagen type I (Collagen Corp., Palo Alto, CA) and 4 × 105 cells were added to the upper compartment in 100 μl of serum-free Dulbecco's modified Eagle's medium. VEGF-C (1 to 100 ng/ml) or the macrophage chemoattractant N-formyl-met-leu-phe (fMLP; 10−6 mol/L) were added to 600 μl of serum-free media in the lower compartment only. After 3 hours, inserts were fixed and washed as described44Senger DR Ledbetter SR Claffey KP Papadopoulos-Sergiou A Perruzzi CA Detmar M Stimulation of endothelial cell migration by vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor through cooperative mechanisms involving the αvβ3 integrin, osteopontin, and thrombin.Am J Pathol. 1996; 149: 293-305PubMed Google Scholar and cell nuclei were stained with propidium iodide. The number of migrated cells was determined by using the IPLab software. For every insert, three fields were evaluated at ×120 magnification. All assays were performed in triplicate. In vitro proliferation rates of transfected MeWo cell clones were determined by using the BrdU labeling and detection kit (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany). Cells were plated in 96-well plates (5 × 103 cells/well; 8 wells/cell clone) and were allowed to proliferate for 24 hours before addition of BrdU (10 μmol/L) for 6 hours. The absorbance was determined at 405 nm using a microtiter plate reader (Titertek, Huntsville, AL). To assess the effect of VEGF or VEGF-C on MeWo cell proliferation, MeWo/control clone 5 was seeded into a 96-well plate at a density of 2.5 × 103 cells/well, and cells were treated for 5 days with 20 ng/ml of recombinant human VEGF-C16Joukov V Sorsa T Kumar V Jeltsch M Claesson WL Cao Y Saksela O Kalkkinen N Alitalo K Proteolytic processing regulates receptor specificity and activity of VEGF-C.EMBO J.

The neurophysiological processes underlying non-invasive brain activity measurements are not well understood. Here, we developed a novel connectome-based brain network model that integrates individual structural and functional data with neural population dynamics to support multi-scale neurophysiological inference. Simulated populations were linked by structural connectivity and, as a novelty, driven by electroencephalography (EEG) source activity. Simulations not only predicted subjects’ individual resting-state functional magnetic resonance imaging (fMRI) time series and spatial network topologies over 20 minutes of activity, but more importantly, they also revealed precise neurophysiological mechanisms that underlie and link six empirical observations from different scales and modalities: (1) slow resting-state fMRI oscillations, (2) spatial topologies of functional connectivity networks, (3) excitation-inhibition balance, (4, 5) pulsed inhibition on short and long time scales, and (6) fMRI power-law scaling. These findings underscore the potential of this new modelling framework for general inference and integration of neurophysiological knowledge to complement empirical studies.

Abstract Presurgical planning for brain tumor resection aims at delineating eloquent tissue in the vicinity of the lesion to spare during surgery. To this end, non-invasive neuroimaging techniques such as functional MRI and diffusion weighted imaging fiber tracking are currently employed. However, taking into account this information is often still insufficient, as the complex non-linear dynamics of the brain impede straightforward prediction of functional outcome after surgical intervention. Large-scale brain network modeling carries the potential to bridge this gap by integrating neuroimaging data with biophysically based models to predict collective brain dynamics. As a first step in this direction, an appropriate computational model has to be selected, after which suitable model parameter values have to be determined. To this end, we simulated large-scale brain dynamics in 25 human brain tumor patients and 11 human control participants using The Virtual Brain, an open-source neuroinformatics platform. Local and global model parameters of the Reduced Wong-Wang model were individually optimized and compared between brain tumor patients and control subjects. In addition, the relationship between model parameters and structural network topology and cognitive performance was assessed. Results showed (1) significantly improved prediction accuracy of individual functional connectivity when using individually optimized model parameters; (2) local model parameters can differentiate between regions directly affected by a tumor, regions distant from a tumor, and regions in a healthy brain; and (3) interesting associations between individually optimized model parameters and structural network topology and cognitive performance.

Abstract Brain tumor patients scheduled for tumor resection often face significant uncertainty, as the outcome of neurosurgery is difficult to predict at the individual patient level. Recently, computational modeling of brain activity using so-called brain network models has been introduced as a promising tool for this purpose. However, brain network models first have to be validated, before they can be used to predict brain dynamics. In prior work, we optimized individual brain network model parameters to maximize the fit with empirical brain activity. In this study, we extend this line of research by examining the stability of fitted parameters before and after tumor resection, and compare it with baseline parameter variability using data from healthy control subjects. Based on these findings, we perform the first “virtual neurosurgery” analyses to evaluate the potential of brain network modeling in predicting brain dynamics after tumor resection. We find that brain network model parameters are relatively stable over time in brain tumor patients who underwent tumor resection, compared with baseline variability in healthy control subjects. In addition, we identify several robust associations between individually optimized model parameters, structural network topology and cognitive performance from pre-to post-operative assessment. Concerning the virtual neurosurgery analyses, we obtain promising results in some patients, whereas the predictive accuracy of the currently applied model is poor in others. These findings reveal interesting avenues for future research, as well as important limitations that warrant further investigation.

Abstract Introduction Neural circuit alterations lay at the core of brain physiopathology, and yet are hard to unveil in living subjects. Virtual brain modelling (TVB), by exploiting structural and functional MRI, yields mesoscopic parameters of connectivity and synaptic transmission. Methods We used TVB to simulate brain networks, which are key for human brain function, in Alzheimer’s disease (AD) and Frontotemporal Dementia (FTD) patients, whose connectivity and synaptic parameters remain largely unknown; we then compared them to healthy controls, to reveal novel in vivo pathological hallmarks. Results The pattern of simulated parameter differed between AD and FTD, shedding light on disease-specific alterations in brain networks. Individual subjects displayed subtle differences in network parameter patterns that significantly correlated with their individual neuropsychological, clinical, and pharmacological profiles. Discussion These TVB simulations, by informing about a new personalized set of networks parameters, open new perspectives for understanding dementias mechanisms and design personalized therapeutic approaches.

1. Abstract Brain Network Models (BNMs) are a family of dynamical systems that simulate whole brain activity using neural mass models to represent local activity in different brain regions that influence each other via a global structural network. Research has been interested in using these network models to explain measured whole brain activity measured via resting state functional magnetic resonance imaging (rs-fMRI). Properties computed over longer periods of simulated and measured data such as average functional connectivity (FC), have shown to be comparable with similar properties estimated from measured rs-fMRI data. While this shows that these network models have similar properties over the dynamical landscape, it is unclear how well simulated trajectories compare with empirical trajectories on a timepoint-by-timepoint basis. Previous studies have shown that BNMs are able to produce relevant features at shorter timescales, but analysis of short-term trajectories or transient dynamics as defined by synchronized predictions from BNM made at the same timescale as the collected data has not yet been conducted. Relevant neural processes exist in the time frame of measurements and are often used in task fMRI studies to understand neural responses to behavioral cues. Therefore, it is important to investigate how much of these dynamics are captured by our current brain simulations. To test the nature of BNMs short term trajectories against observed data, we utilize a deep learning technique known as Neural ODE that based on an observed sequence of fMRI measurements, estimates the initial conditions such that the BNM’s simulation is synchronized to produce the closest trajectory relative to the observed data. We test to see if the parameterization of a specific well studied BNM, the Firing Rate Model, calculated by maximizing its accuracy in reproducing observed short term trajectories matches with the parameterized model that produces the best average long-term metrics. Our results show that such an agreement between parameterization using long and short simulation analysis exists if also considering other factors such as the sensitivity in accuracy with relative to changes in structural connectivity. Therefore, we conclude that there is evidence that by solving for initial conditions, BNMs can be simulated in a meaningful way when comparing against measured data trajectories, although future studies are necessary to establish how BNM activity relate to behavioral variables or to faster neural processes during this time period.

We present raw and processed multimodal empirical data as well as simulation results from a study with The Virtual Brain (TVB). Simultaneous electroencephalography (EEG) - functional magnetic resonance imaging (fMRI) resting-state data, diffusion-weighted MRI, and structural MRI were acquired for 50 healthy adult subjects (18 - 80 years of age) at the Charité University Medicine, Berlin, Germany. We constructed personalized models from this multimodal data with TVB by optimizing parameters on an individual basis that predict multiple empirical features in fMRI and EEG, e.g. dynamic functional connectivity and bimodality in the alpha band power. We annotated this large comprehensive empirical and simulated data set according to the openMINDS meta data schema and structured it following Brain Imaging Data Structure (BIDS) standards for EEG and MRI as well as the BIDS Extension Proposal for computational modeling data. This dataset provides ready-to-use data for future research at various levels of processing including the thereof inferred brain simulation results for a large data set of healthy subjects with a wide age range.

Abstract Background Processing stroke magnetic resonance imaging (MRI) brain data can be susceptible to lesion-based abnormalities. In this study we developed and validated the Lesion Aware automated Processing Pipeline (LeAPP) that incorporates mitigation measures, improving volumetric and connectomics outputs compared to current standards in automated MRI processing pipelines. Methods Building upon the Human Connectome Project (HCP) minimal processing pipeline, we introduced correction measures, such as cost-function masking and virtual brain transplant, and extended functional and diffusion processing to match acquisition protocols often found in a clinical context. A total of 51 participants (36 stroke patients (65.7±12.96 years, 18 female) and 15 healthy controls (69.2±7.4 years, 7 female)) were processed across four time points for patients (3-5, 30-40, 85-95, 340-380 days after stroke onset) and one time point for controls. Artificially lesioned brains (N=82), derived from healthy brains and informed by real stroke lesions were created, thus generating ground-truth data for validation. The processing pipeline and validation framework are available as containerized open-source software. Reconstruction quality has been quantified on whole brain level and for lesion affected and unaffected regions-of-interest (ROIs) using metrics like dice score, volume difference and center-of-gravity distance. Global and local level connectome reconstruction was assessed using node strength, node centrality and clustering coefficient. Results The new pipeline LeAPP provides close reconstructions of the ground truth. Deviations in reconstructed averaged whole brain node strength and all ROI based volume and connectome metrics were significantly reduced compared to the HCP pipeline without stroke specific mitigation measures. Conclusions LeAPP improves reconstruction quality of multimodal MRI processing for brain parcellation and structural connectome estimation significantly over the non-adapted HCP in the presence of lesions and provides a robust framework for diffusion and functional image processing of clinical stroke data. This novel open-source automated processing pipeline contributes to a development towards reproducible research. Graphical abstract

Alzheimer's disease (AD) is marked by cognitive dysfunction emerging from neuropathological processes impacting on brain function. AD affects brain dynamics at the local level, such as changes in the balance of inhibitory and excitatory neuronal populations, as well as long-range changes to the global network. Individual differences in these changes as they relate to behaviour are poorly understood. Here, we use a multi-scale neurophysiological model, The Virtual Brain (TVB), based on empirical multi-modal neuroimaging data, to study how local and global dynamics correlate with individual differences in cognition. In particular, we modelled individual resting-state functional activity of 124 individuals across the behavioral spectrum from healthy aging, to amnesic Mild Cognitive Impairment (MCI), to AD. The model parameters required to accurately simulate empirical functional brain imaging data correlated significantly with cognition, and exceeded the predictive capacity of empirical connectomes.

Brain dynamics span multiple spatial and temporal scales, from fast spiking neurons to slow fluctuations over distributed areas. No single experimental method links data across scales. Here, we bridge this gap using The Virtual Brain connectome-based modelling platform to integrate multimodal data with biophysical models and support neurophysiological inference. Simulated cell populations were linked with subject-specific white-matter connectivity estimates and driven by electroencephalography-derived electric source activity. The models were fit to subject-specific resting-state functional magnetic resonance imaging data, and overfitting was excluded using 5-fold cross-validation. Further evaluation of the models show how balancing excitation with feedback inhibition generates an inverse relationship between α-rhythms and population firing on a faster time scale and resting-state network oscillations on a slower time scale. Lastly, large-scale interactions in the model lead to the emergence of scale-free power-law spectra. Our novel findings underscore the integrative role for computational modelling to complement empirical studies.