Abstract Background Local gene therapies, including in vivo genome editing, are highly anticipated for the treatment of genetic diseases in skin, especially the epidermis. While the adeno-associated virus (AAV) is a potent vector for in vivo gene delivery, the lack of efficient gene delivery methods has limited its clinical applications. Objective To optimize the AAV gene delivery system with higher gene delivery efficiency and specificity for epidermis and keratinocytes (KCs), using AAV capsid and promoter engineering technologies. Methods AAV variants with mutations in residues reported to be critical to determine the tropism of AAV2 for KCs were generated by site-directed mutagenesis of AAVDJ. The infection efficiency and specificity for KCs of these variants were compared with those of previously reported AAVs considered to be suitable for gene delivery to KCs in vitro and in vivo . Additionally, we generated an epidermis-specific promoter using the most recent short-core promoter and compared its specificity with existing promoters. Results A novel AAVDJ variant capsid termed AAVDJK2 was superior to the existing AAVs in terms of gene transduction efficiency and specificity for epidermis and KCs in vitro and in vivo . A novel tissue-specific promoter, termed the K14 SCP3 promoter, was superior to the existing promoters in terms of gene transduction efficiency and specificity for KCs. Conclusion The combination of the AAVDJK2 capsid and K14 SCP3 promoter improves gene delivery to epidermis in vivo and KCs in vitro . The novel AAV system may benefit experimental research and development of new epidermis-targeted gene therapies.

Summary Paragraph Mammalian skin appendages, such as hair follicles and sweat glands, are complex mini-organs formed during skin development 1, 2 . As wounds heal, the resulting scar tissue lacks skin appendages. The clinical regeneration of skin appendages is an ongoing challenge 3, 4 . Skin epithelial tissues have been regenerated in vivo by cellular reprogramming 5, 6 , but the de novo generation of skin appendages has not previously been achieved. Here, we show that transplantation of a type of epithelial cell and two types of mesenchymal cells, reprogrammed from adult mouse subcutaneous mesenchymal cells to mimic developing skin cells, resulted in the generation of skin-appendage-like structures. Furthermore, with the development of a new AAV serotype, in vivo reprogramming of wound-resident cells with the same reprogramming factors generates skin with de novo appendages in adult mice. These findings may provide new therapeutic avenues for skin regeneration and frequent aging-associated skin appendage disorders, such as hair loss and dry skin, and may extend to other tissues and organs. This study also provides the potential for de novo generation of complex organs in vivo .