Abstract The compound eyes of insects exhibit extensive variation in ommatidia number and size, which affects how they see and underlies adaptations in their vision to different environments and lifestyles. However, very little is known about the genetic and developmental bases underlying differences in compound eye size. We previously showed that the larger eyes of Drosophila mauritiana compared to D. simulans is caused by differences in ommatidia size rather than number. Furthermore, we identified an X-linked chromosomal region in D. mauritiana that results in larger eyes when introgressed into D. simulans . Here, we used a combination of fine-scale mapping and gene expression analysis to further investigate positional candidate genes on the X chromosome. We found that orthodenticle is expressed earlier in D. mauritiana than in D. simulans during ommatidial maturation in third instar larvae, and we further show that this gene is required for the correct organisation and size of ommatidia in D. melanogaster . Using ATAC-seq, we have identified several candidate eye enhancers of otd as well as potential direct targets of this transcription factor that are differentially expressed between D. mauritiana and D. simulans . Taken together, our results suggest that differential timing of otd expression contributes to natural variation in ommatidia size between D. mauritiana and D. simulans , which provides new insights into the mechanisms underlying the regulation and evolution of compound eye size in insects.

Abstract Regulation of gene expression is arguably the main mechanism contributing to tissue phenotypic diversity within and between species. Here, we assembled an extensive transcriptomic dataset covering twenty bilaterian species and eight tissues, selecting a specular phylogeny that allowed both the combined and parallel investigation of gene expression evolution between vertebrates and insects. We specifically focused on widely conserved ancestral genes, identifying strong cores of pan-bilaterian tissue-specific genes and even larger groups that diverged to define vertebrate and insect tissues. Systematic inferences of tissue-specificity gains and losses show that nearly half of all ancestral genes have been recruited into tissue-specific transcriptomes. This occurred during both ancient and, especially, recent bilaterian evolution, with several gains being associated with the emergence of unique phenotypes. Such pervasive evolution of tissue-specificity was linked to gene duplication coupled with specialization, including an unappreciated prolonged effect of whole genome duplications during recent vertebrate evolution.

Summary Neurons draw on alternative splicing for their increased transcriptomic complexity throughout animal phylogeny. To delve into the mechanisms controlling the assembly and evolution of this regulatory layer, we characterized the neuronal microexon program in Drosophila and compared it with that of mammals. We found that in Drosophila , this splicing program is restricted to neurons by the post-transcriptional processing of the enhancer of microexons (eMIC) domain in Srrm234 by Elav and Fne. eMIC deficiency or misexpression leads to widespread neurological alterations largely emerging from impaired neuronal activity, as revealed by a combination of neuronal imaging experiments and cell-type-specific rescues. These defects are associated with the genome-wide skipping of short neural exons, which are strongly enriched in ion channels. Remarkably, we found no overlap of eMIC-regulated exons between flies and mice, illustrating how ancient post-transcriptional programs can evolve independently in different phyla to impact distinct cellular modules while maintaining cell-type specificity.

ABSTRACT In the Paleozoic era, more than 400 million years ago, insects continued molting after forming functional wings. Today, however, all flying insects stop molting after metamorphosis when they become fully winged. The only exception is the mayflies (Ephemeroptera), which molt in the subimago, a flying intermediate stage between the nymph and the adult. However, the identity and homology of the subimago remains underexplored. Debate remains regarding whether this stage represents a modified nymph, an adult, or a pupa like that of butterflies. Another relevant question is why do mayflies maintain the subimago stage despite the risk of molting fragile membranous wings. These questions have intrigued numerous authors but nonetheless, clear answers have not yet been found. However, by combining morphological studies, hormonal treatments, and molecular analysis in the mayfly species Cloeon dipterum , we found new answers to these old questions. We observed that treatment with a juvenile hormone analog in the last nymphal instar stimulated the expression of Kr-h1 gene and reduced that of E93 , which suppress and trigger metamorphosis, respectively. Consequently, the subimago is not formed in these treated mayflies. This indicates that metamorphosis is determined prior to the formation of the subimago, which must therefore be considered an instar of the adult stage. We also observed that the forelegs dramatically grow between the last nymphal instar, the subimago, and the adult. This necessary growth is spread over the last two stages, which could explain, at least in part, the adaptive sense of the subimago.

Abstract The first winged insects underwent profound morphological and functional transformations leading to the most successful animal radiations in the history of earth. Despite this, we still have a very incomplete picture of the changes in their genomes that underlay this radiation. Mayflies (Ephemeroptera) are one of the extant sister groups of all other winged insects and therefore are at a key phylogenetic position to understand this radiation. Here, we describe the genome of the cosmopolitan mayfly Cloeon dipterum and study its expression along development and in specific organs. We discover an expansion of odorant-binding proteins, some expressed specifically in the breathing gills of aquatic nymphs, suggesting a novel sensory role for gills. In contrast, as flying adults, mayflies make use of an enlarged set of opsins and utilise these visual genes in a sexually dimorphic manner, with some opsins expressed only in males. Finally, to illuminate the origin of wings, we identify a core set of deeply conserved wing-specific genes at the root of the pterygote insects. Globally, this is the first comprehensive study of the structure and expression of the genome of a paleopteran insect and shows how its genome has kept a record of its functional adaptations.

The size and shape of an organism is tightly controlled during embryonic and postembryonic development to ensure proper functionality. However, in the light of the breath-taking diversity of body forms observed in nature, developmental processes must have evolved to allow evolutionary changes in adult morphology. Therefore, gene regulatory networks (GRNs) that orchestrate organ development are mostly constrained, but nodes and edges within such networks must change to give rise to morphological divergence. Identifying such tuning nodes remains a major challenge in evolutionary developmental biology. Here, we combined comparative transcriptomics and chromatin accessibility data to study developmental differences leading to natural variation in compound eye size and head shape in the two closely related Drosophila species D. melanogaster and D. mauritiana. We show that variation in expression of the GATA transcription factor Pannier (Pnr) is associated with extensive remodeling of the transcriptomic landscape during head development. Since U-shaped (Ush), a co-factor of Pnr, is involved in the same regulatory context, we argue that variation in expression of both factors may be a driver of divergence in head morphology. Applying functional genetics and geometric morphometrics we confirmed that manipulation of pnr expression in D. melanogaster largely phenocopies D. mauritiana dorsal head shape and ommatidia number. Therefore, we propose that the regulatory module composed of Pnr and Ush represents a tuning node within the otherwise highly conserved GRN underlying head development in Drosophila.

Convergent phenotypic evolution is often caused by recurrent changes at particular nodes in the underlying gene regulatory networks (GRNs). The genes at such evolutionary 'hotspots' are thought to maximally affect the phenotype with minimal pleiotropic consequences. This has led to the suggestion that if a GRN is understood in sufficient detail, the path of evolution may be predictable. The repeated evolutionary loss of larval trichomes among Drosophila species is caused by the loss of shavenbaby (svb) expression. svb is also required for development of leg trichomes, but the evolutionary gain of trichomes in the 'naked valley' on T2 femurs in Drosophila melanogaster is caused by the loss of microRNA-92a (miR-92a) expression rather than changes in svb. We compared the expression and function of components between the larval and leg trichome GRNs to investigate why the genetic basis of trichome pattern evolution differs in these developmental contexts. We found key differences between the two networks in both the genes employed, and in the regulation and function of common genes. These differences in the GRNs reveal why mutations in svb are unlikely to contribute to leg trichome evolution and how instead miR-92a represents the key evolutionary switch in this context. Our work shows that variability in GRNs across different developmental contexts, as well as whether a morphological feature is lost versus gained, influence the nodes at which a GRN evolves to cause morphological change. Therefore, our findings have important implications for understanding the pathways and predictability of evolution.

The great capability of insects to adapt to new environments promoted their extraordinary diversification, resulting in the group of Metazoa with the largest number of species distributed worldwide. To understand this enormous diversity, it is essential to investigate lineages that would allow the reconstruction of the early events in the evolution of insects. However, research on insect ecology, physiology, development and evolution has mostly focused on few well-established model species. The key phylogenetic position of mayflies within Paleoptera, as the sister group of the rest of winged insects and life history traits of mayflies make them an essential order to understand insect evolution. Here, we describe the established of a continuous culture system of the mayfly Cloeon dipterum and a series of experimental protocols and -omics resources that allow the study of its development and its great regenerative capability. Thus, the establishment of Cloeon as an experimental platform paves the way to understand genomic and morphogenetic events that occurred at the origin of winged insects.

Abstract The evolution of insects has been marked by the appearance of key body plan innovations and novel organs that promoted the outstanding ability of this lineage to adapt to new habitats, boosting the most successful radiation in animals. To understand the origin and evolution of these new structures, it is essential to investigate which are the genes and gene regulatory networks participating during the embryonic development of insects. Great efforts have been made to fully understand, from a gene expression and gene regulation point of view, the development of holometabolous insects, in particular Drosophila melanogaster , with the generation of numerous functional genomics resources and databases. Conversely, how hemimetabolous insects develop, and which are the dynamics of gene expression and gene regulation that control their embryogenesis, are still poorly characterized. Therefore, to provide a new platform to study gene regulation in insects, we generated ATAC-seq (Assay for transposase-Accessible Chromatin using sequencing) for the first time during the development of the mayfly Cloeon dipterum. This new available resource will allow to better understand the dynamics of gene regulation during hemimetabolan embryogenesis, since C. dipterum belongs to the paleopteran order of Ephemeroptera, the sister group to all other winged insects. These new datasets include six different time points of its embryonic development and identify accessible chromatin regions corresponding to both general and stage-specific promoters and enhancers. With these comprehensive datasets, we characterised pronounced changes in accessible chromatin between stages 8 and 10 of embryonic development, which correspond to the transition from the last stages of segmentation to organogenesis and appendage differentiation. The application of ATAC-seq in mayflies has contributed to identify the epigenetic mechanisms responsible for embryonic development in hemimetabolous insects and it will provide a fundamental resource to understand the evolution of gene regulation in winged insects.

The capacity to regenerate lost or damaged organs is widespread among animals, and yet, the species in which regeneration has been experimentally probed using molecular and functional assays is very small. This is also the case for insects, for which we still lack a complete picture of their regeneration mechanisms and the extent of conservation of these mechanisms. Here we contribute to filling this gap by investigating regeneration in the mayfly Cloeon dipterum. Mayflies, or Ephemeroptera, appeared early in the evolution of insects. We focus on the abdominal gills of Cloeon nymphs, which are critical for osmoregulation and gas exchange. After amputation, gills re-grow faster than they do during normal development. Direct cell count and EdU proliferation assays indicate that growth acceleration involves an uniform increase in cell proliferation throughout the gill, rather than a localized growth zone. Transcriptomic analysis reveals an early enrichment in cell cycle-related genes, in agreement with fast proliferation. Several other gene classes are also enriched in regenerating gills, including protein neddylation and other proteostatic processes. We then showed that protein neddylation, the activin signaling pathway or the mRNA-binding protein Lin28, among other genes and processes, are required for Drosophila larval/pupal wing regeneration, and that some of these genes may have a regeneration-specific function in the wing. Globally, our results contribute to elucidating regeneration mechanisms in mayflies and suggest a conservation of regeneration mechanisms across insects, as evidenced by the regenerative role of candidate genes identified in Cloeon in the distant Drosophila.