Abstract Sequencing of most Treponema pallidum ( T. pallidum ) genomes excludes repeat regions in tp0470 and the tp0433 gene, encoding the acidic repeat protein ( arp ). As a first step to understanding the evolution and function of these genes and the proteins they encode, we developed a protocol to nanopore sequence tp0470 and arp genes from 212 clinical samples collected from ten countries on six continents. Both tp0470 and arp repeat structures recapitulate the whole genome phylogeny, with subclade-specific patterns emerging. The number of tp0470 repeats is on average appears to be higher in Nichols-like clade strains than in SS14-like clade strains. Consistent with previous studies, we found that 14-repeat arp sequences predominate across both major clades, but the combination and order of repeat type varies among subclades, with many arp sequence variants limited to a single subclade. Although strains that were closely related by whole genome sequencing frequently had the same arp repeat length, this was not always the case. Structural modelling of TP0470 suggested that the eight residue repeats form an extended α-helix, predicted to be periplasmic. Modeling of the ARP revealed a C-terminal sporulation-related repeat (SPOR) domain, predicted to bind denuded peptidoglycan, with repeat regions possibly incorporated into a highly charged β- sheet. Outside of the repeats, all TP0470 and ARP amino acid sequences were identical. Together, our data, along with functional considerations, suggests that both TP0470 and ARP proteins may be involved in T. pallidum cell envelope remodeling and homeostasis, with their highly plastic repeat regions playing as-yet-undetermined roles.

ABSTRACT Background Given the resurgence of syphilis, research endeavors to improve current assays for serological diagnosis and management of this disease are a priority. A proteome-scale platform for high-throughput profiling of the humoral response to Treponema pallidum ( T. pallidum ) proteins during infection could identify antigens suitable to ameliorate the performance and capabilities of treponemal tests (TTs), which may require weeks to become positive following infection, cannot distinguish between active and previously treated infections, or assess treatment response. Additionally, because infection-induced immunity is partially protective, profiling the response to T. pallidum outer membrane proteins (OMPs) could help select vaccine candidates. Methods We developed a pan-proteome array (PPA) based on the Nichols and SS14 strain complete proteomes and used it to define the IgM and IgG humoral response to 1,009 T. pallidum proteins in sera collected longitudinally from long-term infected rabbits, and from rabbits that were infected, treated, and re-infected. Findings Approximately a third of the pathogen’s proteome was recognized in infected animals, with a marked IgG response detectable between day-10 and day-20 post-infection. We found early, gradual, and late IgG kinetic profiles, strain-dependent differences in humoral reactivity, and post-treatment fluctuation in reactivity for several antigens. Very few antigens elicited an IgM response. Several OMPs were significantly and differentially recognized, but few elicited a robust response. Interpretation The PPA allowed the identification of antigens that could facilitate early diagnosis and of a core set of OMP that could explain protection upon re-infection. No antigen appeared suitable to monitor treatment response. Funding NIH SBIR-R43AI149804 RESEARCH IN CONTEXT Evidence before this study In April 2024, we searched the PubMed database for articles on preclinical studies using high throughput proteome arrays containing at least 10% of the predicted T. pallidum proteome that aimed at identifying antibody reactivity to T. pallidum antigens during experimental syphilis infection. We could retrieve only one manuscript. In this work, an array containing the T. pallidum partial proteome as annotated in the first sequenced Nichols strain genome (GCA_000008605.1) in 1998 was assembled using recombinant antigens expressed in Escherichia coli ( E. coli ). The resulting array was probed using pooled sera from three rabbits infected with the Nichols stain of T. pallidum , attained from infected animals at five time points following intratesticular infection. The small number of reactive antigens (n = 106) identified in this early study was likely to be an incomplete set of all antigens recognized during infection because not all the predicted targets in the T. pallidum proteome were successfully expressed and tested. In retrospect, additional limitations of the study included an initial suboptimal annotation of the Nichols genome used to define the pathogen’s proteome, which has now changed with the availability of a re-sequenced Nichols strain genome devoid of sequencing errors that affected the initial annotation process, and the refinement of bioinformatic pipelines for the identification of open reading frames (ORFs). Furthermore (as acknowledged by the authors), the possible presence of amplification errors in their expression clones might have affected the sequence of some protein targets and antibody binding to the targets. As a result, some of the T. pallidum antigens known to elicit a robust humoral response during experimental infection were not detected in this antigenic screen. Lastly, employing only the Nichols strain in this early study did not consider that a significant portion of the circulating syphilis strains belong to the SS14 clade of T. pallidum . Added value of this study This novel PPA, combined with a more robust experiential design than ever reported, allowed us to overcome most of the limitations associated with the study mentioned above, as we were able to a) use the most recent annotations for the selected T. pallidum strains based on accurate genome sequences, b) print the pathogen’s virtually complete proteome in the study array, c) analyze individual sera to account for rabbit-to-rabbit variability in the humoral response to infection rather than pooled sera, d) detect both IgM and IgG over 10 or 20 timepoints, depending on the experimental design, e) obtain information on how the humoral response evolved upon treatment and re-infection and, finally, f) evaluate all of the above in animals infected with two T. pallidum strains whose genetic background is representative of the two currently circulating clades of the syphilis agent. Implications of all the available evidence Our study provides new and more comprehensive data on how humoral immunity for two classes of antibodies develops during infection and how it evolves in response to treatment and re-infection. The analysis of sera collected at tightly spaced time points post-inoculation and for an extensive period post-infection provides a wealth of information to improve the diagnostic performance of existing tests detecting treponemal antigens. The analysis of differential immunity specific to the pathogen’s putative OMPs provides a rationale for vaccine candidate selection.

Abstract Background An effective syphilis vaccine should elicit antibodies to Treponema pallidum subsp. pallidum ( T. p. pallidum ) surface antigens to induce pathogen clearance through opsonophagocytosis. Although the combination of bioinformatics, structural, and functional analyses of T. p. pallidum genes to identify putative outer membrane proteins (OMPs) resulted in a list of potential vaccine candidates, still very little is known about whether and how transcription of these genes is regulated during infection. This knowledge gap is a limitation to vaccine design, as immunity generated to an antigen that can be down-regulated or even silenced at the transcriptional level without affecting virulence would not induce clearance of the pathogen, hence allowing disease progression. Principal findings We report here that tp1031 , the T. p. pallidum gene encoding the putative OMP and vaccine candidate TprL is differentially expressed in several T. p. pallidum strains, suggesting transcriptional regulation. Experimental identification of the tprL transcriptional start site revealed that a homopolymeric G sequence of varying length resides within the tprL promoter and that its length affects promoter activity compatible with phase variation. Conversely, in the closely related pathogen T. p. subsp. pertenue , the agent of yaws, where a naturally-occurring deletion has eliminated the tprL promoter region, elements necessary for protein synthesis, and part of the gene ORF, tprL transcription level are negligible compared to T. p. pallidum strains. Accordingly, the humoral response to TprL is absent in yaws-infected laboratory animals and patients compared to syphilis-infected subjects. Conclusion The ability of T. p. pallidum to stochastically vary tprL expression should be considered in any vaccine development effort that includes this antigen. The role of phase variation in contributing to T. p. pallidum antigenic diversity should be further studied. Author Summary Syphilis is still an endemic disease in many low- and middle-income countries and has been resurgent in high-income nations for almost two decades now. In endemic areas, syphilis still causes significant morbidity and mortality in patients, particularly when its causative agent, the bacterium Treponema pallidum subsp . pallidum is transmitted to the fetus during pregnancy. Although there are significant ongoing efforts to identify an effective syphilis vaccine to bring into clinical trials within the decade in the U.S., such efforts are partially hindered by the lack of knowledge on transcriptional regulation of many genes encoding vaccine candidates. Here, we start addressing this knowledge gap for the putative outer membrane protein (OMP) and vaccine candidates TprL, encoded by the tp1031 gene. As we previously reported for other putative OMP-encoding genes of the syphilis agent, tprL transcription level appears to be affected by the length of a homopolymeric sequence of guanosines (Gs) located within the gene promoter. This is a mechanism known as phase variation and often involved in altering the surface antigenic profile of a bacterial pathogen to facilitate immune evasion and/or adaptation to the host milieu.

Abstract Immune evasion by Treponema pallidum subspecies pallidum ( T. pallidum ) has been attributed to antigenic variation of its putative outer-membrane protein TprK. In TprK, amino acid diversity is confined to seven variable (V) regions, and generation of sequence diversity within the V regions occurs via a non-reciprocal segmental gene conversion mechanism where donor cassettes recombine into the tprK expression site. Although previous studies have shown the significant role of immune selection in driving accumulation of TprK variants, the contribution of baseline gene conversion activity to variant diversity is less clear. Here, combining longitudinal tprK deep sequencing of near clonal Chicago C from immunocompetent and immunosuppressed rabbits along with the newly developed in vitro cultivation system for T. pallidum , we directly characterized TprK alleles in the presence and absence of immune selection. Our data confirm significantly greater sequence diversity over time within the V6 region during syphilis infection in immunocompetent rabbits compared to immunosuppressed rabbits, consistent with previous studies on the role of TprK in evasion of the host immune response. Compared to strains grown in immunocompetent rabbits, strains passaged in vitro displayed low level changes in allele frequencies of TprK variable region sequences similar to that of strains passaged in immunosuppressed rabbits. Notably, we found significantly increased rates of V6 allele generation relative to other variable regions in in vitro cultivated T, pallidum strains, illustrating that the diversity within these hypervariable regions occurs in the complete absence of immune selection. Together, our results demonstrate antigenic variation in T. pallidum can be studied in vitro and occurs even in the complete absence of immune pressure, allowing the T. pallidum population to continuously evade the immune system of the infected host. Author Summary Syphilis continues to be a disease of global and public health concern, even though the infection can be easily diagnosed and effectively treated with penicillin. Although infected individuals often develop a strong immunity to the pathogen, repeated infection with the syphilis agent, Treponema pallidum subspecies pallidum ( T. pallidum ), is possible. Several studies point at antigenic variation of the T. pallidum TprK protein as the mechanism responsible for evasion of the immunity that develops during infection, pathogen persistence, and re-infection. Past studies have highlighted the importance of immune clearance of dominant variants that, in turn, allows less represented variants to emerge. The contribution of an immunity-independent baseline generation of variability in the tprK gene is less clear. Here, we used deep sequencing to profile tprK variants using a laboratory-isolated T. pallidum strain nearly isogenic for tprK that was propagated over time in vitro , where no immune pressure is exerted on the pathogen, as well as in samples obtained from immunosuppressed and immunocompetent rabbits infected with the same strain. We confirmed that tprK accumulates significantly more diversity under immune pressure, and demonstrated a low but discernible basal rate of gene conversion in complete absence of immune pressure.

Abstract In spite of its immutable susceptibility to penicillin, Treponema pallidum ( T. pallidum ) subsp. pallidum continues to cause millions of cases of syphilis each year worldwide, resulting in significant morbidity and mortality and underscoring the urgency of developing an effective vaccine to curtail the spread of the infection. Several technical challenges, including absence of an in vitro culture system until very recently, have hampered efforts to catalog the diversity of strains collected worldwide. Here, we provide near-complete genomes from 196 T. pallidum strains – including 191 T. pallidum subsp. pallidum – sequenced directly from patient samples collected from 8 countries and 6 continents. Maximum likelihood phylogeny revealed that samples from most sites were predominantly SS14 clade. However, 99% (84/85) of the samples from Madagascar formed two of the five distinct Nichols subclades. Although recombination was uncommon in the evolution of modern circulating strains, we found multiple putative recombination events between T. pallidum subsp. pallidum and subsp. endemicum , shaping the genomes of several subclades. Temporal analysis dated the most recent common ancestor of Nichols and SS14 clades to 1717 (95% HPD: 1543-1869), in agreement with other recent studies. Rates of SNP accumulation varied significantly among subclades, particularly among different Nichols subclades, and was associated in the Nichols A subclade with a C394F substitution in TP0380, a ERCC3-like DNA repair helicase. Our data highlight the role played by variation in genes encoding putative surface-exposed outer membrane proteins in defining separate lineages, and provide a critical resource for the design of broadly protective syphilis vaccines targeting surface antigens. Author Summary Each year, millions of new cases of venereal and congenital syphilis, caused by the bacterium Treponema pallidum ( T. pallidum ) subsp. pallidum, are diagnosed worldwide, resulting in significant morbidity and mortality. Alongside endemic circulation of syphilis in low-income countries, disease resurgence in high-income nations has underscored the need for a vaccine. Due to prior technological limitations in culturing and sequencing the organism, the extent of the genetic diversity within modern strains of T. pallidum subsp. pallidum remains poorly understood, hampering development of a broadly protective vaccine. In this study, we obtained 196 near-complete T. pallidum genomes directly from clinical swabs from eight countries across six continents. Of these, 191 were identified as T. pallidum subsp. pallidum , including 90 Nichols clade genomes. Bayesian analysis revealed a high degree of variance in mutation rate among subclades. Interestingly, a Nichols subclade with a particularly high mutation rate harbors a non-synonymous mutation in a putative DNA repair helicase. Coupling sequencing data with protein structure prediction, we identified multiple novel amino acid variants in several proteins previously identified as potential vaccine candidates. Our data help inform current efforts to develop a broadly protective syphilis vaccine.