Abstract Stimulated emission depletion (STED) microscopy achieves super-resolution by exciting a diffraction-limited volume and then suppressing fluorescence in its outer parts by depletion. Multiple depletion lasers may introduce misalignment and bleaching. Hence, a single depletion wavelength is preferable for multi-color analyses. However, this limits the number of usable spectral channels. Using cultured cells, common staining protocols, and commercially available fluorochromes and microscopes we exploit that the number of fluorochromes in STED or confocal microscopy can be increased by phasor based fluorescence lifetime separation of two dyes with similar emission spectra but different fluorescent lifetimes. In our multi-color FLIM-STED approach two fluorochromes in the near red (exc. 594 nm, em. 600-630) and two in the far red channel (633/641-680), supplemented by a single further redshifted fluorochrome (670/701-750) were depleted with 775 nm. To the best of our knowledge, these are the first published five color STED images. Generally, this approach doubles the number of fully distinguishable colors in laser scanning microscopy. We provide evidence that eight color FLIM-STED with a single depletion laser would be possible if suitable fluorochromes were identified and we confirm that a fluorochrome may have different lifetimes depending on the molecules to which it is coupled.

ABSTRACT S100A8/A9 is an endogenous alarmin secreted by myeloid cells during many acute and chronic inflammatory disorders. Despite increasing evidence of the proinflammatory effects of extracellular S100A8/A9, little is known about its intracellular function. Here, we show that cytosolic S100A8/A9 is indispensable for neutrophil post-arrest modifications during outside-in signaling under flow conditions in vitro and neutrophil recruitment in vivo, independent of its extracellular functions. Mechanistically, genetic deletion of S100A9 in mice ( Mrp14 -/- , functional S100A8/A9 -/- ) caused dysregulated Ca 2+ signatures in activated neutrophils resulting in reduced Ca 2+ availability at the formed LFA-1/F-actin clusters with defective β 2 integrin outside-in signaling during post-arrest modifications. Consequently, we observed impaired cytoskeletal rearrangement, cell polarization and spreading, as well as cell protrusion formation in Mrp14 -/- compared to WT neutrophils, making Mrp14 -/- cells more susceptible to detach under flow, thereby preventing efficient neutrophil recruitment and extravasation into inflamed tissue. One-sentence summary: intracellular S100A8/A9 is indispensable for firm leukocyte adhesion under flow

How chromatin enzymes work in condensed chromatin and how they maintain diffusional mobility inside remains unexplored. We investigated these challenges using the Drosophila ISWI remodeling ATPase, which slides nucleosomes along DNA. Folding of chromatin fibers did not affect sliding in vitro. Catalytic rates were also comparable in- and outside of chromatin condensates. ISWI cross-links and thereby stiffens condensates, except when ATP hydrolysis is possible. Active hydrolysis is also required for ISWI9s mobility in condensates. Energy from ATP hydrolysis therefore fuels ISWI9s diffusion through chromatin and prevents ISWI from cross-linking chromatin. Molecular dynamics simulations of a 9monkey-bar9 model in which ISWI grabs onto neighboring nucleosomes, then withdraws from one before rebinding another in an ATP hydrolysis-dependent manner qualitatively agree with our data. We speculate that 9monkey-bar9 mechanisms could be shared with other chromatin factors and that changes in chromatin dynamics caused by mutations in remodelers could contribute to pathologies.

Abstract Cellular crosstalk is an essential process influenced by numerous factors including secreted vesicles that transfer nucleic acids, lipids, and proteins between cells. Extracellular vesicles (EVs) have been the center of many studies focusing on neuron-to-neuron communication, but the role of EVs in progenitor-to-neuron and -astrocyte communication and whether EVs display cell-type-specific features for cellular crosstalk during neurogenesis is unknown. Here, using human-derived cerebral organoids, neural progenitors, neurons, and astrocytes, we found that many proteins coded by genes associated with neurodevelopmental disorders are transported via EVs. Thus, we characterized the protein content of EVs and showed their cell type-specific dynamics and function during brain development. Changes in the physiological crosstalk between cells can lead to neurodevelopmental disorders. EVs from patients with epilepsy were found altered in composition and function. Alterations in the intracellular and extracellular compartments highlighted a clear dysregulation of protein trafficking. This study sheds new light on the biology of EVs during brain development and neurodevelopmental disorders. Abstract Figure Graphical abstract (left) EV uptake mechanism varies depending on the receiving cell type; NPCs transport neuron EVs (nEVs) and astrocyte EVs (aEVs) to the nucleus, astrocytes localize progenitor EVs (pEVs) to the cytoplasm, and neurons retain pEVs and aEVs along the plasma membrane. (right) Cerebral organoids (COs) from progressive Myoclonus Epilepsy Type I (EPM1) patients release EVs lacking key proteins in neurodevelopment and proteins necessary for EV biogenesis and release. Illustration created using BioRender.