Real-time deformability cytometry allows the continuous mechanical characterization of cells with high throughput and is applied to distinguish cell-cycle phases, track differentiated cells and profile cell populations in whole blood. We introduce real-time deformability cytometry (RT-DC) for continuous cell mechanical characterization of large populations (>100,000 cells) with analysis rates greater than 100 cells/s. RT-DC is sensitive to cytoskeletal alterations and can distinguish cell-cycle phases, track stem cell differentiation into distinct lineages and identify cell populations in whole blood by their mechanical fingerprints. This technique adds a new marker-free dimension to flow cytometry with diverse applications in biology, biotechnology and medicine.

Abstract Phenotypic variations between individual microbial cells play a key role in the resistance of microbial pathogens to pharmacotherapies. Nevertheless, little is known about cell individuality in antibiotic accumulation. Here we hypothesize that phenotypic diversification can be driven by fundamental cell-to-cell differences in drug transport rates. To test this hypothesis, we employed microfluidics-based single-cell microscopy, libraries of fluorescent antibiotic probes and mathematical modelling. This approach allowed us to rapidly identify phenotypic variants that avoid antibiotic accumulation within populations of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cenocepacia and Staphylococcus aureus . Crucially, we found that fast growing phenotypic variants avoid macrolide accumulation and survive treatment without genetic mutations. These findings are in contrast with the current consensus that cellular dormancy and slow metabolism underlie bacterial survival to antibiotics. Our results also show that fast growing variants display significantly higher expression of ribosomal promoters before drug treatment compared to slow growing variants. Drug-free active ribosomes facilitate essential cellular processes in these fast growing variants, including efflux that can reduce macrolide accumulation. Using this new knowledge, we phenotypically engineered bacterial populations by eradicating variants that displayed low antibiotic accumulation through the chemical manipulation of their outer membrane inspiring new avenues to overcome current antibiotic treatment failures.

Abstract Phage therapy can be used in combination with antibiotics to combat infections with bacterial pathogens 1–3 . However, bacteria can rapidly evolve phage resistance via receptor mutation, or using their CRISPR-Cas adaptive immune systems 4 , which insert short phage-derived sequences into CRISPR loci in the bacterial genome 5 to guide sequence-specific cleavage of cognate sequences 6 . Unlike CRISPR-Cas immunity, mutation of the phage receptor leads to attenuated virulence when the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa is infected with its phage DMS3vir 7 , which underscores the need to predict how phage resistance evolves under clinically relevant conditions. Here, using eight antibiotics with various modes of action, we show that bacteriostatic antibiotics (which inhibit cell growth without killing) specifically promote evolution of CRISPR-Cas immunity in P. aeruginosa by slowing down phage development and providing more time for cells to acquire phage-derived sequences and mount an immune response. Our data show that some antimicrobial treatments can contribute to the evolution of phage-resistant pathogens with high virulence.

ABSTRACT The interaction between a cell and its environment shapes fundamental intracellular processes such as cellular metabolism. In most cases growth rate is treated as a proximal metric for understanding the cellular metabolic status. However, changes in growth rate might not reflect metabolic variations in individuals responding to environmental fluctuations. Here we use single-cell microfluidics-microscopy combined with transcriptomics, proteomics and mathematical modelling to quantify the accumulation of glucose within Escherichia coli cells. In contrast to the current consensus, we reveal that environmental conditions which are comparatively unfavourable for growth, where both nutrients and salinity are depleted, increase glucose accumulation rates in individual bacteria and population subsets. We find that these changes in metabolic function are underpinned by variations at the translational and posttranslational level but not at the transcriptional level and are not dictated by changes in cell size. The metabolic response-characteristics identified greatly advance our fundamental understanding of the interactions between bacteria and their environment and have important ramifications when investigating cellular processes where salinity plays an important role.

Many antibiotics that are used in healthcare, farming and aquaculture end up in environments with different spatial structures that might promote heterogeneity in the emergence of antibiotic resistance. However, experimental evolution of microbes at sub-inhibitory concentrations of antibiotics has been mainly carried out at the population level which does not allow capturing heterogeneity within bacterial populations. Here we investigate and compare the emergence of resistance to ciprofloxacin in Escherichia coli in well mixed and structured environments using experimental evolution, genomics and microfluidics-based time-lapse microscopy. We discover that resistance to ciprofloxacin and cross-resistance to other antibiotics is stronger in the well-mixed environment due to the emergence of target mutations, whereas efflux regulator mutations emerge in the structured environment. The latter mutants also harbour sub-populations of persisters that survive high concentrations of ciprofloxacin that inhibit bacterial growth at the population level. In contrast, genetically resistant bacteria that display target mutations also survive high concentrations of ciprofloxacin that inhibit their growth via population-level antibiotic tolerance. These resistant and tolerant bacteria keep doubling while shrinking in size in the presence of ciprofloxacin and regain their original size after antibiotic removal, which constitutes a newly discovered phenotypic response. This new knowledge sheds light on the diversity of strategies employed by bacteria to survive antibiotics and poses a stepping stone for understanding the link between mutations at the population level and phenotypic single-cell responses.

ABSTRACT Large-scale intracellular signalling during developmental growth or in response to environmental alterations are largely orchestrated by chromatin within the cell nuclei. Chemical and conformational modifications of the chromatin architecture are critical steps in the regulation of differential gene expression and ultimately cell fate determination. Therefore, establishing chemical properties of the nucleus could provide key markers for phenotypic characterisation of cellular processes on a scale of individual cells. Raman microscopy is a sensitive technique that is capable of probing single cell chemical composition - and sub-cellular regions - in a label-free optical manner. As such, it has great potential in both clinical and basic research. However, perceived limitations of Raman spectroscopy such as low signal intensity and the difficulty in linking alterations in vibrational signals directly with ensuing biological effects have hampered advances in the field. Here we use immune B lymphocyte development as a model to assess chromatin and transcriptional changes using confocal Raman microscopy in combination with microfluidic devices and correlative transcriptomics, thereby linking changes in chemical and structural properties to biological outcomes. Live B lymphocytes were assessed before and after maturation. Multivariate analysis was applied to distinguish cellular components within each cell. The spectral differences between non-activated and activated B lymphocytes were then identified, and their correlation with known intracellular biological changes were assessed in comparison to conventional RNA-seq analysis. Our data shows that spectral analysis provides a powerful tool to study gene activation that can complement conventional molecular biology techniques and opens the way for mapping the dynamics in the biochemical makeup of individual cells.

Antimicrobial resistance threatens the viability of modern medical interventions. There is a dire need of developing novel approaches to counter resistance mechanisms employed by starved or slow-growing pathogens that are refractory to conventional antimicrobial therapies. Antimicrobial peptides have been advocated as potential therapeutic solutions due to low levels of genetic resistance observed in bacteria against these compounds. However, here we show that subpopulations of stationary phase Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa survive tachyplesin treatment without genetic mutations. These phenotypic variants induce efflux, outer membrane vesicles secretion and membrane modifications in response to tachyplesin exposure, sequestering the peptide in their membranes where it cannot exert its antimicrobial activity. We discovered that formation of these phenotypic variants could be prevented by administering tachyplesin in combination with sertraline, an existing clinically used inhibitor of transmembrane transporters, suggesting a novel approach for combatting antimicrobial-refractory stationary phase bacteria.

ABSTRACT One of the deepest branches in the tree of life separates the Archaea from the Bacteria. These prokaryotic groups have distinct cellular systems including fundamentally different phospholipid membrane bilayers. This dichotomy has been termed the lipid divide and possibly bestows different biophysical and biochemical characteristics on each cell type. Classic experiments suggest that bacterial membranes (formed from lipids extracted from Escherichia coli for example) show permeability to key metabolites comparable to archaeal membranes (formed from lipids extracted from Halobacterium salinarum ), yet systematic analyses based on direct measurements of membrane permeability are absent. Here we develop a new approach for assessing the membrane permeability of ~10 μm unilamellar vesicles, consisting of an aqueous medium enclosed by a single lipid bilayer. Comparing the permeability of eighteen metabolites demonstrates that diether glycerol-1-phosphate lipids with methyl branches, often the most abundant membrane lipids of known archaea, are permeable to a wide range of compounds useful for core metabolic networks, including amino acids, sugars, and nucleobases. Permeability is significantly lower in diester glycerol-3-phosphate lipids without methyl branches, the common building block of bacterial membranes. To identify the membrane characteristics that determine permeability we use this experimental platform to test a variety of lipid forms bearing a diversity of intermediate characteristics. We found that increased membrane permeability is dependent on both the methyl branches present on the archaeal phospholipid tails and the ether bond between the tails and the head group. These permeability differences must have had profound effects on the cell physiology and proteome evolution of early prokaryotic forms. To explore this further, we compare the abundance and distribution of transmembrane transporter-encoding protein families present on genomes sampled from across the prokaryotic tree of life. Archaea have a reduced repertoire of transporter gene families, consistent with increased membrane permeation. These results demonstrate that the lipid divide demarcates a clear difference in permeability function with implications for understanding some of the earliest transitions in cell evolution.

The interactions between a virus and its host vary in space and time and are affected by the presence of molecules that alter the physiology of either the host or the virus. Determining the dynamics of these interactions is paramount for predicting the fate of bacterial and phage populations and for designing rational phage-antibiotic therapies. We study the interactions between stationary phase Burkholderia thailandensis and the phage phi Bp-AMP1. Although heterogeneous genetic resistance to phage rapidly emerges in B. thailandensis, the presence of phage enhances the efficacy of three major antibiotic classes, the quinolones, the beta-lactams and the tetracyclines, but antagonizes tetrahydrofolate synthesis inhibitors. Enhanced antibiotic efficacy is underpinned by reduced antibiotic efflux in the presence of phage. This new phage-antibiotic therapy allows for eradication of stationary phase bacteria, whilst requiring reduced antibiotic concentrations, which is crucial for treating infections in sites where it is difficult to achieve high antibiotic concentrations.

Abstract The double-membrane cell envelope of Gram-negative bacteria is a formidable barrier to intracellular antibiotic accumulation. A quantitative understanding of antibiotic transport in these cells is crucial for drug development, but this has proved elusive due to the complexity of the problem and a dearth of suitable investigative techniques. Here we combine microfluidics and time-lapse auto-fluorescence microscopy to quantify antibiotic uptake label-free in hundreds of individual Escherichia coli cells. By manipulating the microenvironment, we showed that drug (ofloxacin) accumulation is higher in growing versus non-growing cells. Using genetic knockouts, we provide the first direct evidence that growth phase is more important for drug accumulation than the presence or absence of individual transport pathways. We use our experimental results to inform a mathematical model that predicts drug accumulation kinetics in subcellular compartments. These novel experimental and theoretical results pave the way for the rational design of new Gram-negative antibiotics.