Chronic kidney disease (CKD) is a significant public health problem, and recent genetic studies have identified common CKD susceptibility variants. The CKDGen consortium performed a meta-analysis of genome-wide association data in 67,093 individuals of European ancestry from 20 predominantly population-based studies in order to identify new susceptibility loci for reduced renal function as estimated by serum creatinine (eGFRcrea), serum cystatin c (eGFRcys) and CKD (eGFRcrea < 60 ml/min/1.73 m(2); n = 5,807 individuals with CKD (cases)). Follow-up of the 23 new genome-wide-significant loci (P < 5 x 10(-8)) in 22,982 replication samples identified 13 new loci affecting renal function and CKD (in or near LASS2, GCKR, ALMS1, TFDP2, DAB2, SLC34A1, VEGFA, PRKAG2, PIP5K1B, ATXN2, DACH1, UBE2Q2 and SLC7A9) and 7 loci suspected to affect creatinine production and secretion (CPS1, SLC22A2, TMEM60, WDR37, SLC6A13, WDR72 and BCAS3). These results further our understanding of the biologic mechanisms of kidney function by identifying loci that potentially influence nephrogenesis, podocyte function, angiogenesis, solute transport and metabolic functions of the kidney.

Elevated serum urate levels cause gout and correlate with cardiometabolic diseases via poorly understood mechanisms. We performed a trans-ancestry genome-wide association study of serum urate in 457,690 individuals, identifying 183 loci (147 previously unknown) that improve the prediction of gout in an independent cohort of 334,880 individuals. Serum urate showed significant genetic correlations with many cardiometabolic traits, with genetic causality analyses supporting a substantial role for pleiotropy. Enrichment analysis, fine-mapping of urate-associated loci and colocalization with gene expression in 47 tissues implicated the kidney and liver as the main target organs and prioritized potentially causal genes and variants, including the transcriptional master regulators in the liver and kidney, HNF1A and HNF4A. Experimental validation showed that HNF4A transactivated the promoter of ABCG2, encoding a major urate transporter, in kidney cells, and that HNF4A p.Thr139Ile is a functional variant. Transcriptional coregulation within and across organs may be a general mechanism underlying the observed pleiotropy between urate and cardiometabolic traits. A trans-ancestry genome-wide association study of serum urate levels identifies 183 loci influencing this trait. Enrichment analyses, fine-mapping and colocalization with gene expression in 47 tissues implicate the kidney and liver as key target organs and prioritize potential causal genes.

Although focal and segmental glomerulosclerosis (FSGS) has been in the scientific focus for many years, it is still a massive burden for patients with no causal therapeutic option. In FSGS, podocytes are injured, parietal epithelial cells (PECs) are activated and engage in the formation of cellular lesions leading to progressive glomerular scarring. Herein we show that podocyte-depleted zebrafish larvae develop acute proteinuria, severe foot process effacement and activate PECs which create cellular lesions and deposit extracellular matrix on the glomerular tuft. We therefore propose that this model shows features of human FSGS and show its applicability for a high-throughput drug screening assay.

The tricellular tight junctions are crucial for the regulation of paracellular flux at tricellular junctions, where tricellulin (MARVELD2) and angulins (ILDR1, ILDR2 or LSR) are localized. The role of ILDR2 in podocytes, specialized epithelial cells in the kidney, is still unknown. We investigated the role of ILDR2 in glomeruli and its influence on blood filtration. Western blots, scRNA-seq and superresolution microscopy showed a strong expression of MARVELD2 and ILDR2 in podocytes that colocalizes with the podocyte-specific claudin CLDN5. Co-immunoprecipitation revealed that ILDR2 directly binds CLDN5. In glomerulopathies, induced by nephrotoxic serum and by DOCA-salt heminephrectomy, ILDR2 was strongly upregulated. Furthermore, Ildr2 knockout mice exhibited glomerular hypertrophy and decreased podocyte density, however, did not develop effacement of podocyte foot processes or proteinuria. LC-MS/MS proteomic analysis of isolated glomeruli showed an increase in matrix proteins such as fibronectin and agrin. This suggests a protective role of ILDR2 in glomerulopathies.

Abstract Under healthy conditions, foot processes of neighboring podocytes are interdigitating and connected by an electron-dense slit diaphragm. Beside slit diaphragm proteins, typical adherens junction proteins are also found to be expressed at this cell-cell junction. It is therefore considered as a highly specialized type of adherens junction. During podocyte injury, podocyte foot processes lose their characteristic 3D structure and the filtration slits typical meandering structure gets linearized. It is still under debate how this change of structure leads to the phenomenon of proteinuria. Using super-resolution 3D structured illumination microscopy, we observed a spatially restricted up-regulation of the tight junction protein claudin 5 (CLDN5) in areas where podocyte processes of patients suffering from minimal change disease (MCD), focal and segmental glomerulosclerosis (FSGS) as well as in murine nephrotoxic serum (NTS) nephritis and uninephrectomy DOCA-salt hypertension models, were locally injured. CLDN5/nephrin ratios in human glomerulopathies and NTS-treated mice were significantly higher compared to controls. In patients, the CLDN5/nephrin ratio is significantly correlated with the filtration slit density as a foot process effacement marker, confirming a direct association of local CLDN5 up-regulation in injured foot processes. Moreover, CLDN5 up-regulation was observed in some areas of high filtration slit density, suggesting that CLND5 up-regulation preceded the changes of foot processes. Therefore, CLDN5 could serve as a biomarker predicting early foot process effacement.

Abstract The majority of kidney diseases arise from the loss of podocytes and from morphological changes of their highly complex foot process architecture, which inevitably leads to a reduced kidney filtration and total loss of kidney function. It could have been shown that microRNAs (miRs) play a pivotal role in the pathogenesis of podocyte-associated kidney diseases. Due to their fully functioning pronephric kidney, larval zebrafish have become a popular vertebrate model, to study kidney diseases in vivo . Unfortunately, there is no consensus about a proper normalization strategy of RT-qPCR-based miRNA expression data in zebrafish. In this study we analyzed 9 preselected candidates dre-miR-92a-3p, dre-miR-206-3p, dre-miR-99-1, dre-miR-92b-3p, dre-miR-363-3p, dre-let-7e, dre-miR-454a, dre-miR-30c-5p, dre-miR-126a-5p for their capability as endogenous reference genes in zebrafish experiments. Expression levels of potential candidates were measured in 3 different zebrafish strains, different developmental stages, and in different kidney disease models by RT-qPCR. Expression values were analyzed with NormFinder, BestKeeper, GeNorm, and DeltaCt and were tested for inter-group differences. All candidates show an abundant expression throughout all samples and relatively high stability. The most stable candidate without significant inter-group differences was dre-miR-92b-3p making it a suitable endogenous reference gene for RT-qPCR-based miR expression zebrafish studies.

Abstract Increasing the information depth of single kidney biopsies can improve diagnostic precision, personalized medicine and accelerate basic kidney research. Until now, information on mRNA abundance and morphologic analysis has been obtained from different samples, missing out on the spatial context and single-cell correlation of findings. Herein, we present scoMorphoFISH, a modular toolbox to get spatial single-cell single-mRNA expression data optimized for routinely generated kidney biopsies. Deep-Learning was used to virtually dissect tissue sections in tissue compartments and cell types to which single-cell expression data was assigned. Furthermore, we show correlative and spatial single-cell expression quantification with super-resolved podocyte foot process morphometry on the same histological section. In contrast to bulk analysis methods, this approach will help to identify local transcription changes even in less frequent kidney cell types on a spatial single-cell level with single-mRNA resolution. As this method performs well with standard formalin-fixed paraffin-embedded samples and we provide pretrained DL-networks embedded in a comprehensive image analysis workflow, this method can be applied immediately in a variety of settings.

Abstract Alterations in pre-mRNA splicing play an important role in disease pathophysiology. However, the role of alternative splicing (AS) for podocytes in hypertensive nephropathy (HN) has not been investigated. The purpose of the Sys_CARE project was to identify AS events that play a role in the development and progression of HN. For this, murine podocytes were exposed to mechanical stretch, after which proteins and mRNA were analyzed by proteomics, RNA-Seq and several bioinformatic AS tools. Based on transcriptomics and proteomics analysis we could observe significant changes in gene expression and abundance of proteins under mechanical stretch compared to unstretched conditions. By RNA-Seq, we identified over 1000 different splicing events including all types of AS events. We identified 17 genes that showed an AS event in four different splicing analysis tools. We focused on Myl6 , a component of the myosin protein complex, and Shroom3 , an actin-binding protein crucial for podocyte function. We found two Shroom3 isoforms that showed significant changes in expression upon mechanical stretch, which was verified by qRT-PCR and in situ hybridization. Furthermore, we observed an expression switch of two Myl6 isoforms after mechanical stretch. This switch is accompanied by a change in a C-terminally located amino acid sequence. In summary, mechanical stretch of cultured podocytes is an excellent model to simulate hypertensive nephropathy. In depth RNA-Seq analysis disclosed alternative splicing events, such as in Shroom3 and Myl6 , which may play a crucial role in the pathophysiology of hypertension-induced nephropathy.

Abstract Deep insights into the complex cellular and molecular changes occurring during different (patho-)physiological conditions are essential for understanding the interactions and regulation of different proteins. This understanding is crucial for both research and diagnostics. However, the effectiveness of conventional immunofluorescence, an effective tool for visualizing the spatial distribution of cells or proteins, is limited in complex tissues. This is mainly due to challenges such as the spectral overlap of fluorophore wavelengths, a limited range of antibody types, and the inherent variability of samples. Multiplex immunofluorescence imaging offers a solution to these limitations by enabling precise localization of proteins and identification of different cell types in a single tissue sample. In this study, we demonstrate the cyclic staining and de-staining of paraffin kidney sections, making it suitable for routine use and compatible with super-resolution microscopy for podocyte ultrastructural studies. We have further developed a computerized workflow for data processing which is accessible to all researchers through commercially available reagents and open-access image analysis codes. As a proof of principle, we identified CDH2 as a marker for cellular lesions of sclerotic glomeruli in the nephrotoxic serum nephritis mouse model and cross-validated this finding with a human Nephroseq dataset indicating its translatability. In summary, our work represents a significant advance in multiplex imaging, which is crucial for understanding the localization of numerous proteins in a single FFPE kidney section and the compatibility with super-resolution microscopy to study ultrastructural changes of podocytes.