Abstract Plasma activated water (PAW) contains a cocktail of reactive oxidative species and free radicals and has demonstrated efficacy as a sanitizer for fresh produce, however there is a need for further optimization. The antimicrobial efficacy of PAW produced by a bubble spark discharge (BSD) reactor and a dielectric barrier discharge-diffuser (DBDD) reactor operating at atmospheric conditions with air, discharge frequencies of 500, 1000 and 1500 Hz, and MilliQ and tap water, was investigated with model organisms Listeria innocua and Escherichia coli . Optimal conditions were subsequently employed for pathogenic bacteria Listeria monocytogenes, E. coli and Salmonella enterica . PAW generated with the DBDD reactor reduced more than 6-log CFU of bacteria within 1 minute of treatment. The BSD-PAW, while attaining high CFU reduction was less effective, particularly for L. innocua . Analysis of physicochemical properties revealed BSD-PAW had a greater variety of reactive species than DBDD-PAW. Scavenger assays were employed to specifically sequester reactive species, including the short-lived superoxide (·O 2 - ) radical that could not be directly measured in the PAW. This demonstrated a critical role of superoxide for the inactivation of both E. coli and L. innocua by DBDD-PAW, while in BSD-PAW it had a role in L. innocua inactivation only. Overall, this study demonstrates the potential of DBDD-PAW in fresh produce, where there is a need for sterilization while minimizing chemical inputs and residues and maintaining food quality. Highly effective PAW was generated using air as a processing gas and tap water, making this a feasible and cost-effective option. Importance There is a growing demand for fresh food produced with minimal processing, however guaranteeing microbial safety in the absence of a thermal kill step is challenging. Plasma-activated water (PAW) is a promising novel antimicrobial but its use in high-risk applications like the sanitization of fresh produce requires further optimization. This study demonstrated the importance of reactor design in the production of reactive species in PAW with capacity to kill bacteria. Very effective PAW was generated using a dielectric barrier discharge-diffuser (DBDD) system, with antimicrobial activity attributed to the presence of superoxide radicals. The DBBD reactor used air as a processing gas and tap water, highlighting the potential of this approach as a cost-effective and green alternative to chemical treatment methods that are currently used in food decontamination.

Abstract Healing and treatment of chronic wounds are often complicated due to biofilm formation by pathogens. Here, the efficacy of Plasma Activated Water (PAW) as a pre-treatment strategy has been investigated prior to the application of topical antiseptics polyhexamethylene biguanide, povidone iodine, and MediHoney, which are routinely used to treat chronic wounds. The efficacy of this treatment strategy was determined against biofilms of Escherichia coli formed on a plastic substratum and on a human keratinocyte monolayer substratum used as an in vitro biofilm-skin epithelial cell model. PAW pre-treatment greatly increased the killing efficacy of all the three antiseptics to eradicate the E. coli biofilms formed on the plastic and keratinocyte substrates. However, the efficacy of the combined PAW-antiseptic treatment and single treatments using PAW or antiseptic alone was lower for biofilms formed in the in vitro biofilm-skin epithelial cell model compared to the plastic substratum. Scavenging assays demonstrated that reactive species present within the PAW were largely responsible for its anti-biofilm activity. PAW treatment resulted in significant intracellular RONS accumulation within the E. coli biofilms, while also rapidly acting on the microbial membrane leading to outer membrane permeabilisation and depolarisation. Together, these factors contribute to significant cell death, potentiating the antibacterial effect of the assessed antiseptics.

Abstract Biofilm formation on surfaces, tools and equipment can damage their quality and lead to high repair or replacement costs. Plasma-activated water (PAW), a new technology, has shown promise in killing biofilm and non-biofilm bacteria due to its mix of reactive oxygen and nitrogen species (RONS), and in particular superoxide. However, the specific genetic mechanisms behind PAW’s effectiveness, especially against biofilms, are not yet fully understood. Here, we examined the stress responses of Escherichia coli biofilms when exposed to sub-lethal PAW treatment with and without superoxide (by adding the scavenger Tiron to remove it). A 40% variation in gene expression was observed for PAW treated biofilms when compared to PAW-Tiron and controls. Specifically, PAW treatment resulted in 478 upregulated genes (> 1.5 log2FC) and 186 downregulated genes (< −1.5 log2FC) compared to the control. Pathway enrichment and biological process enrichment analysis revealed significant upregulation of sulfur metabolism, ATP-binding cassette transporter genes, amino acid metabolic/biosynthesis pathways, hypochlorite response systems and oxidative phosphorylation for biofilms treated with PAW compared to control. Knockout mutants of significantly upregulated genes associated with these pathways trxC (4.23-fold), cysP (1.58-fold) and nuoM (1.74-fold) were compared to the wild-type (WT) for their biofilm viability and intracellular RONS accumulation. Relative to PAW-treated WT, ΔtrxC and ΔnuoM knockout mutants displayed significantly reduced biofilm viability (P ≤ 0.05) confirming their role in PAW-mediated response. Interestingly, ΔtrxC biofilms had the highest intracellular ROS accumulation, as revealed by DCFDA staining after PAW treatment. This study gives a detailed insight into how E. coli biofilms respond to oxidative stress induced by PAW. It highlights the significance of superoxide in PAW’s bactericidal effects. Overall, our findings shed light on the specific genes and pathways that help E. coli biofilms survive and respond to PAW treatment, offering a new understanding of plasma technology and its anti-biofilm mechanisms.