ABSTRACT Hematopoietic stem cells (HSCs) are the guarantor of the proper functioning of hematopoiesis due to their incredible diversity of potential. During aging the heterogeneity of mouse HSCs evolves, which contributes to the deterioration of the immune system. Here we address the transcriptional plasticity of HSC upon aging at the single-cell resolution. Through the analysis of 15,000 young and aged transcriptomes, we reveal 15 clusters of HSCs unveiling rare and specific HSC abilities that change with age. Pseudotime ordering complemented with regulon analysis showed that the consecutive differentiation states of HSC are delayed upon aging. By analysing cell cycle at the single cell level we highlight an imbalance of cell cycle regulators of very immature aged HSC that may contribute to their accumulation in an undifferentiated state. Our results therefore establish a reference map of young and old mouse HSC differentiation and reveal a potential mechanism that delay aged HSC differentiation.

Abstract Hematopoietic stem cell (HSC) aging is a multifactorial event that leads to changes in HSC properties and function. These changes are intrinsically coordinated and affect the early hematopoiesis, involving hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). The objective of this work is to better understand the mechanisms and factors controlling these changes. We have therefore developed an original strategy to construct a Boolean network of genes explaining the priming and homeostasis of HSCs (graphical abstract) . Based on our previous scRNA-seq data, we performed an exhaustive analysis of the transcriptional network and identified active transcription modules or regulons along the differentiation trajectory of selected HSPC states. This global view of transcriptional regulation led us to focus on 15 components, 13 selected TFs (Tal1, Fli1, Gata2, Gata1, Zfpm1, Egr1, Junb, Ikzf1, Myc, Cebpa, Bclaf1, Klf1, Spi1) and 2 complexes regulating the ability of HSC to cycle (CDK4/6 - Cyclin D and CIP/KIP). We then defined the connections controlling the differentiation dynamics of HSC states and constructed an influence graph between the TFs involved in the dynamics by mixing observations from our scRNA-seq data and knowledge from the literature. Then, using answer set programming (ASP) and in silico perturbation analysis, we obtained a Boolean model which is the solution of a Boolean satisfiability problem. Finally, perturbation of the model based on age-related changes revealed important regulations, such as the overactivation of Egr1 and Junb or the loss of Cebpa activation by Gata2, which were found to be relevant for the myeloid bias of aged HSC. Our work shows the efficiency of the combination of manual and systematic methods to elaborate a Boolean model. The developed strategy led to the proposal of new regulatory mechanisms underlying the differentiation bias of aged HSCs, explaining the decreased transcriptional priming of HSCs to all mature cell types except megakaryocytes. Graphical abstract From single cell RNA-seq (scRNA-seq) data and current knowledge in early hematopoiesis (literature and biological database investigation), 3 inputs were obtained to define the network synthesis as a Boolean Satisfiability Problem depending on observations of states in the differentiation process: Influence graph between selected components. Discretized component activity levels in the considered states (blue: 0/inactive, white: */unknown or free, red: 1/active). Dynamic relations (stable states, (non) reachability) between the considered states. Then, these inputs were encoded as constraints in Answer Set Programing (ASP) thanks to the Bonesis tool. After the solving, a Boolean model of early hematopoiesis is obtained. This model is altered according to the characteristics of aging observed in our scRNA-seq data, in order to identify the main molecular actors and mechanisms of aging. Graphical abstract: Overview of the scRNA-seq assisted gene Boolean network synthesis strategy.

PLZF (promyelocytic leukemia zinc finger) is a transcription factor acting as a global regulator of hematopoietic commitment. PLZF displays an epigenetic specificity by recruiting chromatin-modifying factors but little is known about its role in remodeling chromatin of cells committed towards a given specific hematopoietic lineage. In murine myeloid progenitors, we decipher a new role for PLZF in restraining active genes and enhancers by targeting acetylated lysine 27 of Histone H3 (H3K27ac). Functional analyses reveal that active enhancers bound by PLZF are involved in biological processes related to metabolism and associated with hematopoietic aging. Comparing the epigenome of young and old myeloid progenitors, we reveal that H3K27ac variation at active enhancers is a hallmark of hematopoietic aging. Taken together, these data suggest that PLZF, associated with active enhancers, appears to restrain their activity as an epigenetic gatekeeper of hematopoietic aging.

Autophagy is an essential cellular process that maintains homeostasis by recycling damaged organelles and nutrients during development and cellular stress. ZKSCAN3 is the sole identified master transcriptional repressor of autophagy in humans. How ZKSCAN3 achieves autophagy repression at the mechanistic or organismal level however still remains to be elucidated. Here, we demonstrate that vertebrate ZKSCAN3 and Drosophila M1BP are functionally homologous transcription factors in autophagy repression. Expression of ZKSCAN3 in Drosophila prevents premature autophagy onset due to loss of M1BP function and conversely, M1BP expression in human cells can prevent starvation-induced autophagy due to loss of nuclear ZKSCAN3 function. In Drosophila ZKSCAN3 binds genome-wide to sequences targeted by M1BP and transcriptionally regulates the majority of M1BP-controlled genes. These data allow the potential for transitioning the mechanisms, gene targets and plethora metabolic processes controlled by M1BP onto ZKSCAN3 and opens up Drosophila as a tool in studying the function of ZKSCAN3 in autophagy and tumourigenesis.

ABSTRACT Cytogenetic normal AML with NPM1 mutations forms a distinct AML entity, associated with an intermediate prognosis and a heterogeneous response to treatment. We previously described an epigenetic biomarker, defined by the level of H3K27me3 on 70kb of the HIST1 cluster in patient blast DNA. This epigenetic mark separates cytogenetically normal NPM1 mut AML into two groups of patients differing in their survival rate following chemotherapy. To better characterize the influence of the biomarker on disease progression, we performed transcriptomic and histone mark profiling on patient blasts according to the level of H3K27me3 HIST1 . Our integrated analysis revealed that the two groups of patients display differences in terms of transcriptomic, chromatin landscape and cell surface markers, which could explain the clinical difference. Our profiling revealed novel targets and therefore constitutes an (epi)transcriptomic resource for NPM1 AML. It also highlights the power of epigenetic profiling to dissect the heterogeneity of a single AML genetic entity.

ABSTRACT Cancer relapse is caused by a subset of malignant cells that are resistant to treatment. To characterize resistant cells and their vulnerabilities, we studied the retinoic acid (RA)-resistant PLZF-RARA acute promyelocytic leukemia (APL) using single-cell multi-omics. We uncovered transcriptional and chromatin heterogeneity in leukemia cells and identified a subset of cells resistant to RA that depend on a fine-tuned transcriptional network targeting the epigenetic regulator Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2). Epigenomic and functional analyses validated EZH2 selective dependency of PLZF-RARA leukemia and its driver role in RA resistance. Targeting pan-EZH2 activities (canonical/non-canonical) was necessary to eliminate leukemia relapse initiating cells, which underlies a dependency of resistant cells on an EZH2 non-canonical activity and the necessity to degrade EZH2 to overcome resistance. Our study provides critical insights into the mechanisms of RA resistance that allow us to eliminate treatment-resistant leukemia cells by targeting EZH2, thus highlighting a potential targeted therapy approach. HIGHLIGHTS - sc-RNAseq identifies PLZF-RARA leukemia heterogeneity and retinoic acid resistant cells - sc-ATACseq refines leukemic cell identity and resolves retinoic acid resistant networks - EZH2 is a selective dependency of PLZF-RARA leukemia and drives retinoic acid resistance - Targeting pan-EZH2 activities (canonical/non-canonical) is necessary to overcome leukemia onset