COVID-19 vaccines based on the Spike protein of SARS-CoV-2 have been developed that appear to be largely successful in stopping infection. However, vaccine escape variants might arise leading to a re-emergence of COVID. In anticipation of such a scenario, the identification of repurposed drugs that stop SARS-CoV-2 replication could have enormous utility in stemming the disease. Here, using a nano-luciferase tagged version of the virus (SARS-CoV-2- DOrf7a-NLuc) to quantitate viral load, we evaluated a range of human cell types for their ability to be infected and support replication of the virus, and performed a screen of 1971 FDA-approved drugs. Hepatocytes, kidney glomerulus, and proximal tubule cells were particularly effective in supporting SARS-CoV-2 replication, which is in- line with reported proteinuria and liver damage in patients with COVID-19. We identified 35 drugs that reduced viral replication in Vero and human hepatocytes when treated prior to SARS-CoV-2 infection and found amodiaquine, atovaquone, bedaquiline, ebastine, LY2835219, manidipine, panobinostat, and vitamin D3 to be effective in slowing SARS-CoV-2 replication in human cells when used to treat infected cells. In conclusion, our study has identified strong candidates for drug repurposing, which could prove powerful additions to the treatment of COVID.

Abstract Collagen-I fibrillogenesis is crucial to health and development, where dysregulation is a hallmark of fibroproliferative diseases. Here, we show that collagen-I fibril assembly required a functional endocytic system that recycles collagen-I to assemble new fibrils. Endogenous collagen production was not required for fibrillogenesis if exogenous collagen was available, but the circadian-regulated vacuolar protein sorting (VPS) 33b and collagen-binding integrin-α11 subunit were crucial to fibrillogenesis. Cells lacking VPS33b secrete soluble collagen-I protomers but were deficient in fibril formation, thus secretion and assembly are separately controlled. Overexpression of VPS33b led to loss of fibril rhythmicity and over-abundance of fibrils, which was mediated through integrin α11β1. Endocytic recycling of collagen-I was enhanced in human fibroblasts isolated from idiopathic pulmonary fibrosis, where VPS33b and integrin-α11 subunit were overexpressed at the fibrogenic front; this correlation between VPS33b, integrin-α11 subunit, and abnormal collagen deposition was also observed in samples from patients with chronic skin wounds. In conclusion, our study showed that circadian-regulated endocytic recycling is central to homeostatic assembly of collagen fibrils and is disrupted in diseases.

Collagen is the most abundant secreted protein in vertebrates that persists throughout life without renewal. The unchanging nature of collagen contrasts with observed continued collagen synthesis throughout adulthood and with conventional transcriptional and translational homeostatic mechanisms that replace damaged proteins with new copies. Here we show circadian clock regulation of procollagen transport from ER-to-Golgi and Golgi-to-plasma membrane by sequential rhythmic expression of SEC61, TANGO1, PDE4D and VPS33B. The result is nocturnal procollagen synthesis and daytime collagen fibril assembly in mice. Rhythmic collagen degradation by CTSK maintains collagen homeostasis. This circadian cycle of collagen synthesis, assembly and degradation affects only a pool of newly-synthesized collagen whilst maintaining the persistent collagen network. Disabling the circadian clock causes collagen accumulation and abnormal fibrils in vivo . In conclusion, our study has identified a circadian clock mechanism of protein homeostasis in which a sacrificial pool of collagen is synthesized and removed to maintain tissue function.

Abstract Collagen is a key structural component of multicellular organisms and is arranged in a highly organised manner. In structural tissues such as tendons, collagen forms bundles of parallel fibres between cells, which appear within a 24 hour window between E13.5 and E14.5 during mouse embryonic development. Current models assume that the organised structure of collagen requires direct cellular control, whereby cells actively lay down collagen fibrils from cell surfaces. However, such models appear incompatible with the time- and length-scales of fibril formation. We propose a phase-transition model to account for the rapid development of ordered fibrils in embryonic tendon, reducing reliance on active cellular processes. We develop phase-field crystal simulations of collagen fibrillogenesis in domains derived from electron micrographs of inter-cellular spaces in embryonic tendon and compare results qualitatively and quantitatively to observed patterns of fibril formation. To test the prediction of this phase-transition model that free protomeric collagen should exist in the intercellular spaces prior to the formation of observable fibrils, we use laser-capture microdissection, coupled with mass spectrometry, which demonstrates steadily increasing free collagen in intercellular spaces up to E13.5, followed by a rapid reduction of free collagen that coincides with the appearance of less soluble collagen fibrils. The model and measurements together provide evidence for extracellular self-assembly of collagen fibrils in embryonic mouse tendon, supporting an additional mechanism for rapid collagen fibril formation during embryonic development.

Electron microscopy has been the gold standard for studying collagen networks but dynamic information on how cells synthesise the networks has been lacking. Live imaging methods have been unable to distinguish newly-synthesised fibrils from pre-existing fibrils and intracellular collagen. Here, we tagged endogenous collagen-I using CRISPR-Cas9 with photoswitchable Dendra2 and demonstrate live cells synthesising, migrating on, and interacting with, collagen fibrils. This strategy is applicable for other long half-life proteins.

Basement membranes (BMs) provide structural support to tissues and influence cell signaling. Mutations in COL4A1/COL4A2, a major BM component, cause eye, kidney and cerebrovascular disease, including stroke. Common variants in these genes are risk factors for intracerebral hemorrhage in the general population. However, the contribution of the matrix to the disease mechanism(s) and its effects on the biology of cells harboring a collagen IV mutation remain poorly understood. To shed light on this, we engineered controlled microenvironments using polymer biointerfaces coated with ECM proteins laminin or fibronectin (FN), to investigate the cellular phenotype of primary fibroblasts harboring a COL4A2+/G702D mutation. FN nanonetworks assembled on poly(ethyl acrylate) (PEA) induced increased deposition and assembly of collagen IV in COL4A2+/G702D cells, which was associated with reduced ER size and enhanced levels of protein chaperones such as BIP, suggesting increased protein folding capacity of cells. FN nanonetworks on PEA also partially rescued the reduced stiffness of the deposited matrix and cells, and enhanced cell adhesion through β1-mediated signaling and actin-myosin contractility, effectively rescuing some of the cellular phenotypes associated with COL4A1/4A2 mutations. Collectively, these results suggest that biomaterials are able to shape the matrix and cellular phenotype of the COL4A2+/G702D mutation in patient-derived cells.

Collagen fibrils are the primary supporting scaffold of vertebrate tissues but how they are assembled is unclear. Here, using CRISPR-tagging of type I collagen and SILAC labelling, we elucidate the cellular mechanism for the spatiotemporal assembly of collagen fibrils, in cultured fibroblasts. Our findings reveal multifaceted trafficking of collagen, including constitutive secretion, intracellular pooling, and plasma membrane-directed fibrillogenesis. Notably, we differentiate the processes of collagen secretion and fibril assembly and identify the crucial involvement of endocytosis in regulating fibril formation. By employing Col1a1 knockout fibroblasts we demonstrate the incorporation of exogenous collagen into nucleation sites at the plasma membrane through these recycling mechanisms. Our study sheds light on the assembly process and its regulation in health and disease. Mass spectrometry data are available via ProteomeXchange with identifier PXD036794.

ABSTRACT The circadian clock in tendon regulates the daily rhythmic synthesis of collagen-I and the appearance and disappearance of small-diameter collagen fibrils in the extracellular matrix. How the fibrils are assembled and removed is not fully understood. Here, we first showed that the collagenase, membrane type I-matrix metalloproteinase (MT1-MMP, encoded by Mmp14 ), is regulated by the circadian clock in postnatal mouse tendon. Next, we generated tamoxifen-induced Col1a2-Cre-ERT2::Mmp14 KO mice ( Mmp14 conditional knockout (CKO)). The CKO mice developed hind limb dorsiflexion and thickened tendons, which accumulated narrow-diameter collagen fibrils causing ultrastructural disorganization. Mass spectrometry of control tendons identified 1195 proteins of which 212 showed time-dependent abundance. In Mmp14 CKO mice 19 proteins had reversed temporal abundance and 176 proteins lost time dependency. Among these, the collagen crosslinking enzymes lysyl oxidase-like 1 (LOXL1) and lysyl hydroxylase 1 (LH1; encoded by Plod2 ) were elevated and had lost time-dependent regulation. High-pressure chromatography confirmed elevated levels of hydroxylysine aldehyde (pyridinoline) crosslinking of collagen in CKO tendons. As a result, collagen-I was refractory to extraction. We also showed that CRISPR-Cas9 deletion of Mmp14 from cultured fibroblasts resulted in loss of circadian clock rhythmicity of period 2 (PER2), and recombinant MT1-MMP was highly effective at cleaving soluble collagen-I but less effective at cleaving collagen pre-assembled into fibrils. In conclusion, our study shows that circadian clock-regulated Mmp14 controls the rhythmic synthesis of small diameter collagen fibrils, regulates collagen crosslinking, and its absence disrupts the circadian clock and matrisome in tendon fibroblasts.