Tissues can be soft like fat, which bears little stress, or stiff like bone, which sustains high stress, but whether there is a systematic relationship between tissue mechanics and differentiation is unknown. Here, proteomics analyses revealed that levels of the nucleoskeletal protein lamin-A scaled with tissue elasticity, E, as did levels of collagens in the extracellular matrix that determine E. Stem cell differentiation into fat on soft matrix was enhanced by low lamin-A levels, whereas differentiation into bone on stiff matrix was enhanced by high lamin-A levels. Matrix stiffness directly influenced lamin-A protein levels, and, although lamin-A transcription was regulated by the vitamin A/retinoic acid (RA) pathway with broad roles in development, nuclear entry of RA receptors was modulated by lamin-A protein. Tissue stiffness and stress thus increase lamin-A levels, which stabilize the nucleus while also contributing to lineage determination.

Cell migration through solid tissue often involves large contortions of the nucleus, but biological significance is largely unclear. The nucleoskeletal protein lamin-A varies both within and between cell types and was shown here to contribute to cell sorting and survival in migration through constraining micropores. Lamin-A proved rate-limiting in 3D migration of diverse human cells that ranged from glioma and adenocarcinoma lines to primary mesenchymal stem cells (MSCs). Stoichiometry of A- to B-type lamins established an activation barrier, with high lamin-A:B producing extruded nuclear shapes after migration. Because the juxtaposed A and B polymer assemblies respectively conferred viscous and elastic stiffness to the nucleus, subpopulations with different A:B levels sorted in 3D migration. However, net migration was also biphasic in lamin-A, as wild-type lamin-A levels protected against stress-induced death, whereas deep knockdown caused broad defects in stress resistance. In vivo xenografts proved consistent with A:B-based cell sorting, and intermediate A:B-enhanced tumor growth. Lamins thus impede 3D migration but also promote survival against migration-induced stresses.

Tissue microenvironments are characterized not only in terms of chemical composition but also by collective properties such as stiffness, which influences the contractility of a cell, its adherent morphology, and even differentiation [1Discher D.E. Janmey P. Wang Y.L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.Science. 2005; 310: 1139-1143Crossref PubMed Scopus (4802) Google Scholar, 2Engler A.J. Sen S. Sweeney H.L. Discher D.E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.Cell. 2006; 126: 677-689Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (10276) Google Scholar, 3Levental K.R. Yu H. Kass L. Lakins J.N. Egeblad M. Erler J.T. Fong S.F.T. Csiszar K. Giaccia A. Weninger W. et al.Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.Cell. 2009; 139: 891-906Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2764) Google Scholar, 4Sawada Y. Tamada M. Dubin-Thaler B.J. Cherniavskaya O. Sakai R. Tanaka S. Sheetz M.P. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas.Cell. 2006; 127: 1015-1026Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (732) Google Scholar, 5Even-Ram S. Doyle A.D. Conti M.A. Matsumoto K. Adelstein R.S. Yamada K.M. Myosin IIA regulates cell motility and actomyosin-microtubule crosstalk.Nat. Cell Biol. 2007; 9: 299-309Crossref PubMed Scopus (386) Google Scholar, 6Gardel M.L. Schneider I.C. Aratyn-Schaus Y. Waterman C.M. Mechanical integration of actin and adhesion dynamics in cell migration.Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2010; 26: 315-333Crossref PubMed Scopus (646) Google Scholar, 7Dupont S. Morsut L. Aragona M. Enzo E. Giulitti S. Cordenonsi M. Zanconato F. Le Digabel J. Forcato M. Bicciato S. et al.Role of YAP/TAZ in mechanotransduction.Nature. 2011; 474: 179-183Crossref PubMed Scopus (3273) Google Scholar, 8Pelham Jr., R.J. Wang Yl. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997; 94: 13661-13665Crossref PubMed Scopus (2449) Google Scholar]. The nucleoskeletal protein lamin-A,C increases with matrix stiffness, confers nuclear mechanical properties, and influences differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs), whereas B-type lamins remain relatively constant [9Swift J. Ivanovska I.L. Buxboim A. Harada T. Dingal P.C.D.P. Pinter J. Pajerowski J.D. Spinler K.R. Shin J.-W. Tewari M. et al.Nuclear lamin-A scales with tissue stiffness and enhances matrix-directed differentiation.Science. 2013; 341: 1240104Crossref PubMed Scopus (1200) Google Scholar]. Here we show in single-cell analyses that matrix stiffness couples to myosin-II activity to promote lamin-A,C dephosphorylation at Ser22, which regulates turnover, lamina physical properties, and actomyosin expression. Lamin-A,C phosphorylation is low in interphase versus dividing cells, and its levels rise with states of nuclear rounding in which myosin-II generates little to no tension. Phosphorylated lamin-A,C localizes to nucleoplasm, and phosphorylation is enriched on lamin-A,C fragments and is suppressed by a cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor. Lamin-A,C knockdown in primary MSCs suppresses transcripts predominantly among actomyosin genes, especially in the serum response factor (SRF) pathway. Levels of myosin-IIA thus parallel levels of lamin-A,C, with phosphosite mutants revealing a key role for phosphoregulation. In modeling the system as a parsimonious gene circuit, we show that tension-dependent stabilization of lamin-A,C and myosin-IIA can suitably couple nuclear and cell morphology downstream of matrix mechanics.

The extracellular matrix (ECM) is the noncellular scaffolding component present within all tissues and organs. It provides crucial biochemical and biomechanical cues to instruct cellular behavior and has been shown to be under circadian clock regulation, a highly conserved cell-intrinsic timekeeping mechanism that has evolved with the 24-hour rhythmic environment. Aging is a major risk factor for many diseases, including cancer, fibrosis, and neurodegenerative disorders. Both aging and our modern 24/7 society disrupt circadian rhythms, which could contribute to altered ECM homeostasis. Understanding the daily dynamics of ECM and how this mechanism changes with age will have a profound impact on tissue health, disease prevention, and improving treatments. Maintaining rhythmic oscillations has been proposed as a hallmark of health. On the other hand, many hallmarks of aging turn out to be key regulators of circadian timekeeping mechanisms. In this review, we summarize new work linking the ECM with circadian clocks and tissue aging. We discuss how the changes in the biomechanical and biochemical properties of ECM during aging may contribute to circadian clock dysregulation. We also consider how the dampening of clocks with age could compromise the daily dynamic regulation of ECM homeostasis in matrix-rich tissues. This review aims to encourage new concepts and testable hypotheses about the two-way interactions between circadian clocks and ECM in the context of aging.

Collagen is the most abundant secreted protein in vertebrates that persists throughout life without renewal. The unchanging nature of collagen contrasts with observed continued collagen synthesis throughout adulthood and with conventional transcriptional and translational homeostatic mechanisms that replace damaged proteins with new copies. Here we show circadian clock regulation of procollagen transport from ER-to-Golgi and Golgi-to-plasma membrane by sequential rhythmic expression of SEC61, TANGO1, PDE4D and VPS33B. The result is nocturnal procollagen synthesis and daytime collagen fibril assembly in mice. Rhythmic collagen degradation by CTSK maintains collagen homeostasis. This circadian cycle of collagen synthesis, assembly and degradation affects only a pool of newly-synthesized collagen whilst maintaining the persistent collagen network. Disabling the circadian clock causes collagen accumulation and abnormal fibrils in vivo . In conclusion, our study has identified a circadian clock mechanism of protein homeostasis in which a sacrificial pool of collagen is synthesized and removed to maintain tissue function.

Abstract Although dysfunctional protein homeostasis (proteostasis) is a key factor in many age-related diseases, the untargeted identification of structural modifications in proteins remains challenging. Peptide location fingerprinting is a proteomic analysis technique capable of identifying structural modification-associated differences in mass spectrometry (MS) datasets of complex biological samples. A new webtool (Manchester Peptide Location Fingerprinter), applied to photoaged and intrinsically aged skin proteomes, can relatively quantify peptides (spectral counting) and map statistically significant differences to regions within protein structures. New photoageing biomarkers were identified in multiple proteins including matrix components (collagens and proteoglycans), oxidation and protease modulators (peroxiredoxins and SERPINs) and cytoskeletal proteins (keratins). Crucially, for many extracellular biomarkers, structural modification-associated differences were not correlated with relative abundance (by ion intensity). By applying peptide location fingerprinting to published MS datasets, (identifying biomarkers including collagen V and versican in ageing tendon) we demonstrate the potential of the MPLF webtool to discover novel biomarkers.

ABSTRACT Cells respond to stress by synthesising chaperone proteins that correct protein misfolding to maintain function. However, protein homeostasis is lost in ageing, leading to aggregates characteristic of protein-folding diseases. Whilst much is known about how these diseases progress, discovering what causes protein-folding to deteriorate could be key to their prevention. Here, we examined primary human mesenchymal stem cells (hMSCs), cultured to a point of replicative senescence and subjected to heat shock, as an in vitro model of the ageing stress response. We found through proteomic analysis that the maintenance of homeostasis deteriorated in senescent cells. Time-resolved analysis of factors regulating heat shock protein 70 kDa (HSPA1A) revealed a lack of capacities for protein turnover and translation to be key factors in limiting the stress response during senescence. A kinetic model predicted a consequence of these reduced capacities to be the accumulation of misfolded protein, a hypothesis supported by evidence of systematic changes to protein fold state. These results thus further our understanding of the underlying mechanistic links between ageing and loss of protein homeostasis.

Abstract The Golgi apparatus comprises a connected ribbon of stacked cisternal membranes localized to the perinuclear region of most vertebrate cells. The position and morphology of this organelle depends upon interactions with microtubules and the actin cytoskeleton. In contrast, we know relatively little about the relationship of the Golgi apparatus with intermediate filaments. In this study we show that the Golgi is in close physical proximity to vimentin intermediate filaments (IFs) in cultured mouse and human cells. We also show that the trans -Golgi network coiled-coil protein GORAB can physically associate with IFs. Although loss of vimentin and/or GORAB does not have major effects upon Golgi morphology at steady-state, the Golgi undergoes more rapid disassembly upon chemical disruption with the drug brefeldin A, and slower reassembly upon drug washout, in vimentin knockout cells. Moreover, loss of vimentin causes reduced Golgi ribbon integrity when cells are cultured on high stiffness hydrogels, which is exacerbated by loss of GORAB. These results indicate that vimentin IFs contribute to the structural stability of the Golgi apparatus, and suggest a role for GORAB in this process.

Summary Microenvironmental stiffness regulates the behaviour of both normal and cancer cells. In breast tissue, high mammographic density (HMD), which reflects greater organisation and stiffness of the periductal collagen, represents a significant risk factor for cancer. However, the mechanistic link between extracellular matrix (ECM) stiffness and increased risk of breast tumour initiation remains unclear. In particular, how increased ECM stiffness might promote genomic damage, leading to the acquisition of transforming mutations, remains to be determined. Here we determine that ECM stiffness induces changes in mammary epithelial cell (MEC) metabolism that drive genomic damage. Using a 3D-culture model, we demonstrate that genome-wide transcriptional changes in response to increased ECM stiffness impair the ability of MECs to remove reactive aldehyde species, resulting in greater accumulation of DNA damage in a RhoA-dependent manner. Together, our results provide a mechanistic link between increased ECM stiffness and the genomic damage required for breast cancer initiation.

ABSTRACT Tissues are maintained by homeostatic feedback mechanisms where cells respond to, but also modify, the chemical and mechanical properties of the surrounding extracellular matrix. Mesenchymal stem cells (MSCs) resident in the marrow niche experience a diverse mechanical environment, but ageing can affect the composition and quality of bone and marrow tissues. Here we quantified the effect of replication-induced senescence on MSC morphology and their ability to correctly respond to different substrate stiffnesses. The matrix proteome was found to be sensitive to substrate stiffness, but pharmacological inhibition of cellular contractility perturbed this response, decreasing levels of tenascin-C, fibulins and fibronectin. Similar decreases in these mechanosensitive proteins were observed in senescent cells, suggested a decoupling of mechanotransduction pathways. Intracellular proteomic and transcriptomic analyses confirmed a decrease in components of the cytoskeletal chaperone complex CCT/TRiC in senescent MSCs. Finally, pharmacological inhibition of CCT/TRiC was able to partially recapitulate senescence-associated morphological changes in non-senescent MSCs. These results demonstrate a senescence-mediated perturbation to cytoskeletal homeostasis, pathways of mechanotransduction and the secretion of matrix proteins required for tissue maintenance.