Carboxylic acid reductases (CARs) selectively reduce carboxylic acids to aldehydes using ATP and NADPH as cofactors under mild conditions. Although CARs attracts significant interest, only a few enzymes have been characterized to date, whereas the vast majority of CARs have yet to be examined. Herein the authors report that 12 bacterial CARs reduces a broad range of bifunctional carboxylic acids containing oxo‐, hydroxy‐, amino‐, or second carboxyl groups with several enzymes showing activity toward 4‐hydroxybutanoic (4‐HB) and adipic acids. These CARs exhibits significant reductase activity against substrates whose second functional group is separated from the carboxylate by at least three carbons with both carboxylate groups being reduced in dicarboxylic acids. Purified CARs supplemented with cofactor regenerating systems (for ATP and NADPH), an inorganic pyrophosphatase, and an aldo‐keto reductase catalyzes a high conversion (50–76%) of 4‐HB to 1,4‐butanediol (1,4‐BDO) and adipic acid to 1,6‐hexanediol (1,6‐HDO). Likewise, Escherichia coli strains expressing eight different CARs efficiently reduces 4‐HB to 1,4‐BDO with 50–95% conversion, whereas adipic acid is reduced to a mixture of 6‐hydroxyhexanoic acid (6‐HHA) and 1,6‐HDO. Thus, our results illustrate the broad biochemical diversity of bacterial CARs and their compatibility with other enzymes for applications in biocatalysis.

Microbes in ecosystems often develop coordinated metabolic interactions. Therefore, understanding metabolic interdependencies between microbes is critical to deciphering ecosystem function. In this study, we sought to deconstruct metabolic interdependencies in organohalide-respiring consortium ACT-3 containing Dehalobacter restrictus using a combination of metabolic modeling and experimental validation. D. restrictus possesses a complete set of genes for amino acid biosynthesis yet when grown in isolation requires amino acid supplementation. We reconciled this discrepancy using flux balance analysis considering cofactor availability, enzyme promiscuity, and shared protein expression patterns for several D. restrictus strains. Experimentally, 13C incorporation assays, growth assays, and metabolite analysis of D. restrictus strain PER-K23 cultures were performed to validate the model predictions. The model resolved that the amino acid dependency of D. restrictus resulted from restricted NADPH regeneration and predicted that malate supplementation would replenish intracellular NADPH. Interestingly, we observed unexpected export of pyruvate and glutamate in parallel to malate consumption in strain PER-K23 cultures. Further experimental analysis using the ACT-3 transfer cultures suggested the occurrence of an interspecies malate-pyruvate shuttle reconciling a redox imbalance, reminiscent of the mitochondrial malate shunt pathway in eukaryotic cells. Altogether, this study suggests that redox imbalance and metabolic complementarity are important driving forces for metabolite exchange in anaerobic microbial communities.

Abstract Background Aldehyde decarbonylases (ADs), which convert acyl aldehydes into alkanes, supply promising solution for producing alkanes from renewable feedstock. However the instability of ADs impedes their further application. Therefore, the current study aimed to investigate the degradation mechanism of ADs and engineer it towards high stability. Results Here, we describe the discovery of a degradation tag (degron) in the AD from marine cyanobacterium Prochlorococcus marinus using error-prone PCR-based directed evolution system. Bioinformatic analysis revealed that this C-terminal degron is common in bacterial ADs and identified a conserved C-terminal motif, RMSAYGLAAA, representing the AD degron (ADcon). Furthermore, we demonstrated that the ATP-dependent proteases ClpAP and Lon are involved in the degradation of AD-tagged proteins in E. coli , thereby limiting alkane production. Deletion or modification of the degron motif increased alkane production in vivo. Conclusion This work revealed the presence of a novel degron in bacterial ADs responsible for its instability. The in vivo experiments proved eliminating or modifying the degron could stabilize AD, thereby producing higher titers of alkanes.

Abstract NOD1 and NOD2 are intracellular sensors of bacterial peptidoglycan that belong to the Nod-like receptor (NLR) family of innate immune proteins. In addition to their role as direct bacterial sensors, it was recently proposed that NOD proteins could detect endoplasmic reticulum (ER) stress induced by thapsigargin, an inhibitor of the sarcoplasmic or endoplasmic reticulum calcium ATPase family (SERCA) that pumps Ca 2+ into the ER, resulting in pro-inflammatory signalling. Here, we confirm that thapsigargin induces pro-inflammatory signalling in epithelial cells in a NOD-dependent manner. However, the effect was specific to thapsigargin, as tunicamycin and the subtilase cytotoxin SubAB from Shiga toxigenic Escherichia coli, which induce ER stress by other mechanisms, did not induce cytokine expression. The calcium ionophore A23187 also induced NOD-dependent signalling, and the calcium chelator BAPTA-AM blunted thapsigargin-dependent pro-inflammatory signalling, showing NOD proteins responded to a rise in intracellular Ca 2+ . Since intracellular Ca 2+ directly affects vesicular trafficking, we tested if thapsigargin-induced NOD activation required endocytosis. Our results demonstrate that both endocytosis and the addition of serum to the cell culture medium were required for thapsigargin-mediated NOD activation. Finally, we analyzed cell culture grade fetal calf serum as well as serum from laboratory mice by high-pressure liquid chromatography and mass spectrometry, and identified the presence of various peptidoglycan fragments. We propose that cellular perturbations that affect intracellular Ca 2+ can trigger internalization of peptidoglycan trace contaminants found in culture serum, thereby stimulating pro-inflammatory signalling. The presence of peptidoglycan in animal serum suggests that a homeostatic function of NOD signalling may have been previously overlooked.

Abstract Reductive dehalogenases (RDases) are a family of redox enzymes that are required for anaerobic organohalide respiration, a microbial process that is useful in bioremediation. Structural and mechanistic studies of these enzymes have been greatly impeded due to challenges in RDase heterologous expression, primarily because of their cobamide-dependence. There have been a few successful attempts at RDase production in unconventional heterologous hosts, but a robust method has yet to be developed. In this work we outline a novel respiratory RDase expression system using Escherichia coli as the host. The overexpression of E. coli ’s cobamide transport system, btu , and RDase expression under anaerobic conditions were established to be essential for the expression of active RDases from Dehalobacter - an obligate organohalide respiring bacterium. The expression system was validated on six RDase enzymes with amino acid sequence identities ranging from >30-95%. Dehalogenation activity was verified for each RDase by assaying cell-free extracts of small-scale expression cultures on various chlorinated substrates including chloroalkanes, chloroethenes, and hexachlorocyclohexanes. Two RDases, TmrA from Dehalobacter sp. UNSWDHB and HchA from Dehalobacter sp. HCH1, were purified by nickel affinity chromatography. Incorporation of both the cobamide and iron-sulfur cluster cofactors was verified, and the specific activity of TmrA was found to be consistent with that of the native enzyme. The heterologous expression of respiratory RDases, particularly from obligate organohalide respiring bacteria, has been extremely challenging and unreliable. Here we present a relatively straightforward E. coli expression system that has performed well for a variety of Dehalobacter spp. RDases. IMPORTANCE Understanding microbial reductive dehalogenation is important to refine the global halogen cycle and to improve bioremediation of halogenated contaminants; however, studies of the family of enzymes responsible are limited. Characterization of reductive dehalogenase enzymes has largely eluded researchers due to the lack of a reliable and high-yielding production method. We are presenting an approach to express reductive dehalogenase enzymes from Dehalobacter , a key group of organisms used in bioremediation, in E. coli . This expression system will propel the study of reductive dehalogenases by facilitating their production and isolation, allowing researchers to pursue more in-depth questions about the activity and structure of these enzymes. This platform will also provide a starting point to improve the expression of reductive dehalogenases from many other organisms.

Abstract Background: Aldehyde decarbonylases (ADs), which convert acyl aldehydes into alkanes, supply promising solution for producing alkanes from renewable feedstock. However the instability of ADs impedes their further application. Therefore, the current study aimed to investigate the degradation mechanism of ADs and engineer it towards high stability. Results: Here, we describe the discovery of a degradation tag (degron) in the AD from marine cyanobacterium Prochlorococcus marinus using error-prone PCR based directed evolution system. Bioinformatic analysis revealed that this C-terminal degron is common in bacterial ADs and identified a conserved C-terminal motif, RMSAYGLAAA, representing the AD degron (ADcon). Furthermore, we demonstrated that the ATP-dependent proteases ClpAP and Lon are involved in the degradation of AD-tagged proteins in E. coli , thereby limiting alkane production. Deletion or modification of the degron motif increased alkane production in vivo . Conclusion: This work revealed the presence of a novel degron in bacterial ADs responsible for its instability. The in vivo experiments proved eliminating or modifying the degron could stabilize AD, thereby producing higher titers of alkanes.

Non-structural protein 3 (Nsp3) is the largest open reading frame encoded in the SARS-CoV-2 genome, essential for formation of double-membrane vesicles (DMV) wherein viral RNA replication occurs. We conducted an extensive structure-function analysis of Nsp3 and determined the crystal structures of the Ubiquitin-like 1 (Ubl1), Nucleic Acid Binding (NAB), β-coronavirus-Specific Marker (βSM) domains and a sub-region of the Y domain of this protein. We show that the Ubl1, ADP-ribose phosphatase (ADRP), human SARS Unique (HSUD), NAB, and Y domains of Nsp3 bind the 5′ UTR of the viral genome and that the Ubl1 and Y domains possess affinity for recognition of this region, suggesting high specificity. The Ubl1-Nucleocapsid (N) protein complex binds the 5′ UTR with greater affinity than the individual proteins alone. Our results suggest that multiple domains of Nsp3, particularly Ubl1 and Y, shepherd the 5′ UTR of viral genome during translocation through the DMV membrane, priming the Ubl1 domain to load the genome onto N protein.

Abstract Background: Aldehyde decarbonylase (AD), which converts acyl aldehydes into alkanes, supplies promising solution for producing alkanes from renewable feedstock. However the instability of AD impeded its further application. Therefore, the current study aimed to investigate the degradation mechanism of AD and engineer it towards high stability. Results: Here, we describe the discovery of a degradation tag (degron) in the AD from marine cyanobacterium Prochlorococcus marinus via error-prone PCR based directed evolution system. Bioinformatic analysis revealed this C-terminal degron is common in the family of bacterial ADs and identified a conserved C-terminal motif, RMSAYGLAAA, representing the AD degron (ADcon). Furthermore, we demonstrated that the ATP-dependent proteases ClpAP and Lon are involved in the degradation of AD-tagged proteins in E. coli , thereby limiting alkane production. Deletion or modification of the degron motif increased alkane production in vivo . Conclusions: This work revealed the presence of a novel degron in bacterial ADs responsible for its instability. The in vivo experiments proved eliminating or modifying the degron could stabilize AD, thereby producing higher titers of alkanes.

Abstract Most microorganisms in the biosphere live in communities and develop coordinated metabolisms via trading metabolites. In this study, we sought to deconstruct the metabolic interdependency in organohalide-respiring microbial communities enriched with Dehalobacter restrictus ( Dhb ), using a complementary approach of computational metabolic modeling and experimental validation. Dhb possesses a complete set of genes for amino acid biosynthesis yet requires amino acid supplementation. We reconciled this discrepancy using Flux Balance Analysis with consideration for cofactor availability, enzyme promiscuity, and shared protein expression patterns of several Dhb strains. Experimentally, 13 C incorporation assays, growth assays, and metabolite analysis of strain PER-K23 cultures were performed to validate the model predictions. The model resolved that Dhb ’s amino acid dependency results from restricted NADPH regeneration and diagnosed that malate supplementation can replenish intracellular NADPH using malic enzyme. Interestingly, we observed unexpected export of glutamate and pyruvate in parallel to malate consumption in the strain PER-K23 cultures. Further experiments on Dhb -enriched consortium ACT-3 suggested an interspecies malate-pyruvate shuttle between Dhb and a glutamate-auxotrophic Bacteroides sp., reminiscent of the mitochondrial malate shunt pathway in eukaryotic cells. Altogether, this study reveals that redox constraints and metabolic complementarity are important driving forces for amino acid exchange in anaerobic microbial communities.

Chlordecone (C10Cl10O) is a bishomocubane molecule, that has been used as pesticide, in many countries in Europe, America, and Africa, from the 1960’s to 1990’s. In the French West Indies, the historic use of chlordecone to control banana weevil infestations has resulted in pollution of large land areas. Although currently banned, chlordecone persists because it adsorbs strongly to soil and its complex structure is stable, particularly under aerobic conditions. A leaching model established that CLD pollution will last in French west indies soils several decades to half a millennium depending on soil type. However, abiotic chemical transformation catalyzed by reduced vitamin B12 has been shown to break down chlordecone by opening the cage structure to produce C9 polychloroindenes, and more recently these C9 polychloroindenes were also observed as products of anaerobic microbiological transformation by Citrobacter . To assess the potential for bioremediation, the anaerobic biotransformation of chlordecone by microbes native to soils from the French West Indies was investigated. Anaerobic microcosms were constructed from chlordecone impacted Guadeloupe soil and sludge to mimic natural attenuation and eletron donor-stimulated reductive dechlorination. Original microcosms and transfers were incubated over a period of 8 years, during which they were repeatedly amended with chlordecone and electron donor (ethanol and acetone). Using LC/MS, chlordecone and degradation products were detected in all the biologically active microcosms. Observed products in active incubations included monohydro-, dihydro- and trihydrochlordecone derivatives (C10Cl10−nO2Hn, n= 1,2,3), as well as “open cage” C9 polychloroindene compounds (C9Cl5−nH3+n, n=0,1,2) and C10 carboxylated polychloroindene derivatives (C10Cl4−nO2H4+n, n=0−3). Products with as many as 9 chlorine atoms removed were detected. These products were not observed in sterile incubations. Chlordecone concentrations decreased in active microcosms as concentrations of products increased, indicating that anaerobic dechlorination processes have occurred. An crude estimation of partitioning coefficients between soil and water showed that carboxylated intermediates sorb poorly, and as a consequence may be flushed away while polychlorinated indenes sorb strongly to soil. Microbial community analysis in microcosms showed enrichment of anaerobic fermenting and acetogenic microbes possibly involved in anaerobic chlordecone biotransformation. It thus should be possible to stimuilate anaerobic dechlorination through donor amendment to contaminated soils, particularly as some metabolites (in particular pentachloroindene) were already detected in field samples as a result of intrinsic processes. Extensive dechlorination in the microcosms, with evidence for up to 9 Cl atoms removed from the parent molecule is game-changing, giving hope to the possibility of using bioremediation to reduce the impact of CLD contamination.