Abstract SARS-CoV-2 is the causative agent behind the COVID-19 pandemic, and responsible for over 170 million infections, and over 3.7 million deaths worldwide. Efforts to test, treat and vaccinate against this pathogen all benefit from an improved understanding of the basic biology of SARS-CoV-2. Both viral and cellular proteases play a crucial role in SARS-CoV-2 replication, and inhibitors targeting proteases have already shown success at inhibiting SARS-CoV-2 in cell culture models. Here, we study proteolytic cleavage of viral and cellular proteins in two cell line models of SARS-CoV-2 replication using mass spectrometry to identify protein neo-N-termini generated through protease activity. We identify previously unknown cleavage sites in multiple viral proteins, including major antigenic proteins S and N, which are the main targets for vaccine and antibody testing efforts. We discovered significant increases in cellular cleavage events consistent with cleavage by SARS-CoV-2 main protease, and identify 14 potential high-confidence substrates of the main and papain-like proteases, validating a subset with in vitro assays. We showed that siRNA depletion of these cellular proteins inhibits SARS-CoV-2 replication, and that drugs targeting two of these proteins: the tyrosine kinase SRC and Ser/Thr kinase MYLK, showed a dose-dependent reduction in SARS-CoV-2 titres. Overall, our study provides a powerful resource to understand proteolysis in the context of viral infection, and to inform the development of targeted strategies to inhibit SARS-CoV-2 and treat COVID-19.

Salmonella Typhimurium ST313 causes invasive nontyphoidal Salmonella (iNTS) disease in sub-Saharan Africa, targeting susceptible HIV+, malarial or malnourished individuals. An in-depth genomic comparison between the ST313 isolate D23580, and the well-characterized ST19 isolate 4/74 that causes gastroenteritis across the globe, revealed extensive synteny. To understand how the 856 nucleotide variations generated phenotypic differences, we devised a large-scale experimental approach that involved the global gene expression analysis of strains D23580 and 4/74 grown in sixteen infection-relevant growth conditions. Comparison of transcriptional patterns identified virulence and metabolic genes that were differentially expressed between D23580 versus 4/74, many of which were validated by proteomics. We also uncovered the S. Typhimurium D23580 and 4/74 genes that showed expression differences during infection of murine macrophages. Our comparative transcriptomic data are presented in a new enhanced version of the Salmonella expression compendium SalComD23580: bioinf.gen.tcd.ie/cgi-bin/salcom_v2.pl. We discovered that the ablation of melibiose utilization was caused by 3 independent SNP mutations in D23580 that are shared across ST313 lineage 2, suggesting that the ability to catabolise this carbon source has been negatively selected during ST313 evolution. The data revealed a novel plasmid maintenance system involving a plasmid-encoded CysS cysteinyl-tRNA synthetase, highlighting the power of large-scale comparative multi-condition analyses to pinpoint key phenotypic differences between bacterial pathovariants.

Acute pancreatitis (AP) is acute inflammation of the pancreas, mainly caused by gallstones and alcohol, driven by changes in communication between cells. Heparin-binding proteins (HBPs) play a central role in health and diseases. Therefore, we used heparin affinity proteomics to identify extracellular HBPs in pancreas and plasma of normal mice and in a caerulein mouse model of AP. Many new extracellular HBPs (360) were discovered in the pancreas, taking the total number of HBPs known to 786. Extracellular pancreas HBPs form highly interconnected protein-protein interaction networks in both normal pancreas (NP) and AP. Thus, HBPs represent an important set of extracellular proteins with significant regulatory potential in the pancreas. HBPs in NP are associated with biological functions such as molecular transport and cellular movement that underlie pancreatic homeostasis. However, in AP HBPs are associated with additional inflammatory processes such as acute phase response signalling, complement activation and mitochondrial dysfunction, which has a central role in the development of AP. Plasma HBPs in AP included known AP biomarkers such as serum amyloid A, as well as emerging targets such as histone H2A. Other HBPs such as alpha 2-HS glycoprotein (AHSG) and histidine-rich glycoprotein (HRG) need further investigation for potential applications in the management of AP. Pancreas HBPs are extracellular and so easily accessible and are potential drug targets in AP, whereas plasma HBPs represent potential biomarkers for AP. Thus, their identification paves the way to determine which HBPs may have potential applications in the management of AP.

Abstract Adaption of cells to low oxygen environments is an essential process mediated in part by the Hypoxia Inducible Factors (HIFs). Like other transcription factors, the stability and transcriptional activity of HIFs, and consequently the hypoxic response, are regulated by post-translational modification (PTM) and changes in biomolecular interactions. However, our current understanding of PTM-mediated regulation of HIFs is primarily based on in vitro protein fragment-based studies, with validation typically having been conducted by in cellulo fragment expression and hypoxia mimicking drugs. Consequently, we still lack an understanding of true oxygen deprivation signaling via HIFα. Using an immunoprecipitation-based, mass spectrometry approach, we characterize the regulation of in cellulo expressed full-length HIF-1α and HIF-2α, in terms of both PTM and binding partners, in response to normoxia (21% oxygen) and hypoxia (1% oxygen). These studies revealed that a change in oxygen tension significantly alters the complexity and composition of HIF-α protein interaction networks, with HIF-2α in particular having an extended hypoxia-induced interactome, most notably with mitochondrial-associated proteins. Both HIFα isoforms are heavily covalently modified: we define ~40 different sites of PTM on each of HIF-1α and HIF-2α, comprising 13 different PTM types, including multiple cysteine modifications and a highly unusual phosphocysteine. Over 80% of the PTMs identified are novel, and approximately half exhibit oxygen-dependency under these conditions. Combined with domain and evolutionary analysis of >225 vertebrate species, we validate Ser31 phosphorylation on HIF-1α as a regulator of transcription, and propose functional roles for Thr406, Thr528 and Ser581 on HIF-2α.

The majority of bacterial genomes have high coding efficiencies, but there are some genomes of intracellular bacteria that have low gene density. The genome of the endosymbiont Sodalis glossinidius contains almost 50% pseudogenes containing mutations that putatively silence them at the genomic level. We have applied multiple 'omic strategies, combining: Illumina and Pacific Biosciences Single-Molecule Real Time DNA-sequencing and annotation; stranded RNA-sequencing; and proteome analysis to better understand the transcriptional and translational landscape of Sodalis pseudogenes, and potential mechanisms for their control. Between 53% and 74% of the Sodalis transcriptome remains active in cell-free culture. Mean sense transcription from Coding Domain Sequences (CDS) is four-times greater than that from pseudogenes. Comparative genomic analysis of six Illumina-sequenced Sodalis isolates from different host Glossina species shows pseudogenes make up ~40% of the 2,729 genes in the core genome, suggesting that they are stable and/or Sodalis is a recent introduction across the Glossina genus as a facultative symbiont. These data further shed light on the importance of transcriptional and translational control in deciphering host-microbe interactions. The combination of genomics, transcriptomics and proteomics give a multidimensional perspective for studying prokaryotic genomes with a view to elucidating evolutionary adaptation to novel environmental niches.

Protein phosphorylation is a ubiquitous post-translational modification (PTM) that regulates all aspects of life. To date, investigation of human cell signalling has focussed on canonical phosphorylation of serine (Ser), threonine (Thr) and tyrosine (Tyr) residues. However, mounting evidence suggests that phosphorylation of histidine also plays a central role in regulating cell biology. Phosphoproteomics workflows rely on acidic conditions for phosphopeptide enrichment, which are incompatible with the analysis of acid-labile phosphorylation such as histidine. Consequently, the extent of non-canonical phosphorylation is likely to be under-estimated. We report an Unbiased Phosphopeptide enrichment strategy based on Strong Anion Exchange (SAX) chromatography (UPAX), which permits enrichment of acid-labile phosphopeptides for characterisation by mass spectrometry. Using this approach, we identify extensive and positional phosphorylation patterns on histidine, arginine, lysine, aspartate and glutamate in human cell extracts, including 310 phosphohistidine and >1000 phospholysine sites of protein modification. Remarkably, the extent of phosphorylation on individual non-canonical residues vastly exceeds that of basal phosphotyrosine. Our study reveals the previously unappreciated diversity of protein phosphorylation in human cells, and opens up avenues for exploring roles of acid-labile phosphorylation in any proteome using mass spectrometry.

Abstract Organisation of the transcription cycle is facilitated by the reversible phosphorylation of the C-terminal domain of RNA Polymerase II (RNAPII-CTD) and its accessory factors. The PNUTS-PP1 protein phosphatase is crucial for mRNA synthesis and processing, yet the complete spectrum of its physiological targets in these processes remain elusive. Here, using quantitative phosphoproteomics, we discover that Cdk11, in addition to various spliceosomal and RNA processing factors, associates with PNUTS, and that disruption of PP1-binding results in hyperphosphorylation of Cdk11 at an evolutionarily conserved Serine residue, seven amino acid residues C-terminal to DFG residues in the activation loop. In vitro experiments reveal a role for Ser DFG+7 in modulating Cdk11 kinase activity towards RNAPII-CTD Ser5. Making use of a novel technique to conditionally disrupt PP1 binding, we show that PNUTS-PP1 normally serves to restrain Cdk11 phosphorylation in vivo . Mutational analysis shows that cdk11 is not only essential for survival but also plays a widespread role in regulating normal mRNA expression and splicing. Notably, we find that a phosphomimetic mutation in cdk11 exhibits distinct biological effects compared to loss of cdk11 function, including defective processing of intronic small nucleolar RNAs, diminished intronic RNA Pol II velocity, and a decrease in intergenic transcription. These findings underscore physiologically significant roles of Cdk11 dephosphorylation by PNUTS-PP1 in the regulation of mRNA transcription and processing.

ABSTRACT Polo-like kinase 4 (PLK4) is the master regulator of centriole duplication in metazoan organisms. Catalytic activity and protein turnover of PLK4 are tightly coupled in human cells, since changes in PLK4 concentration and catalysis have profound effects on centriole duplication and supernumerary centrosomes, which are associated with aneuploidy and cancer. Recently, PLK4 has been targeted with a variety of small molecule kinase inhibitors exemplified by centrinone, which rapidly induces inhibitory effects on PLK4 and leads to on-target centrosome depletion. Despite this, relatively few PLK4 substrates have been identified unequivocally in human cells, and PLK4 signaling outside centriolar networks remains poorly characterised. We report an unbiased mass spectrometry (MS)-based quantitative analysis of cellular protein phosphorylation in stable PLK4-expressing U2OS human cells exposed to centrinone. PLK4 phosphorylation was itself sensitive to brief exposure to the compound, resulting in PLK4 stabilization. Analysing asynchronous cell populations, we report hundreds of centrinone-regulated cellular phosphoproteins, including centrosomal and cell cycle proteins and a variety of likely ‘non-canonical’ substrates. Surprisingly, sequence interrogation of ~300 significantly down-regulated phosphoproteins reveals an extensive network of centrinone-sensitive [Ser/Thr]Pro phosphorylation sequence motifs, which based on our analysis might be either direct or indirect targets of PLK4. In addition, we confirm that NMYC and PTPN12 are PLK4 substrates, both in vitro and in human cells. Our findings suggest that PLK4 catalytic output directly controls the phosphorylation of a diverse set of cellular proteins, including Pro-directed targets that are likely to be important in PLK4-mediated cell signaling.

ABSTRACT Protein tyrosine sulfation (sY) is a post-translational modification (PTM) catalysed by Golgi-resident Tyrosyl Protein SulfoTransferases (TPSTs). Information on protein tyrosine sulfation is currently limited to ∼50 human proteins with only a handful having verified sites of sulfation. The contribution of this chemical moiety for the regulation of biological processes, both inside and outside the cell, remains poorly defined, in large part due to analytical limitations. Mass spectrometry-based proteomics is the method of choice for PTM analysis, but has yet to be applied for the systematic investigation and large-scale analysis of biomolecular sulfation (constituting the ‘sulfome’), primarily due to issues associated with discrimination of sY-from phosphotyrosine (pY)-containing peptides. In this study, we developed a mass spectrometry (MS)-based workflow centred on the characterization of sY-peptides, incorporating optimised Zr 4+ -IMAC and TiO 2 enrichment strategies. Extensive characterization of a panel of sY- and pY-peptides using an array of MS fragmentation regimes (CID, HCD, EThcC, ETciD, UVPD) highlights differences in the ability to generate site-determining product ions, which can be exploited to differentiate sulfated peptides from nominally isobaric phosphopeptides based on precursor ion neutral loss at low collision energy. Application of our analytical workflow to a HEK-293 cell extracellular secretome facilitated identification of 21 new sulfotyrosine-containing proteins, several of which we validate enzymatically using in vitro sulfation assays. This study demonstrates the applicability of our strategy for confident, high-throughput, ‘sulfomics’ studies, and reveals new sY interplay between enzymes relevant to both protein and glycan sulfation.

ABSTRACT Different types of DNA damage can initiate phosphorylation-mediated signalling cascades that result in stimulus specific pro- or anti-apoptotic cellular responses. Amongst its many roles, the NF-κB transcription factor RelA is central to these DNA damage response pathways. However, we still lack understanding of the co-ordinated signalling mechanisms that permit different DNA damaging agents to induce distinct cellular outcomes through RelA. Here, we use label-free quantitative phosphoproteomics to examine the temporal effects of exposure of U2OS cells to either etoposide (ETO) or hydroxyurea (HU) by monitoring the phosphorylation status of RelA and its protein binding partners. Although few stimulus-specific differences were identified in the constituents of phosphorylated RelA interactome after exposure to these DNA damaging agents, we observed subtle, but significant, changes in their phosphorylation states, as a function of both type and duration of treatment. The DNA double strand break (DSB)-inducing ETO invoked more rapid, sustained responses than HU, with regulated targets primarily involved in transcription, cell division and canonical DSB repair. Kinase substrate prediction of ETO-regulated phosphosites suggest abrogation of CDK1 and ERK1 signalling, in addition to the known induction of ATM/ATR. In contrast, HU-induced replicative stress mediated temporally dynamic regulation, with phosphorylated RelA binding partners having roles in rRNA/mRNA processing and translational initiation, many of which contained a 14-3-3ε binding motif, and were putative substrates of the dual specificity kinase CLK1. Our data thus point to differential regulation of key cellular processes and the involvement of distinct signalling pathways in modulating DNA damage-specific functions of RelA.