Abstract Brexanolone (allopregnanolone), was recently approved by the FDA for the treatment of post-partum depression, demonstrating long-lasting antidepressant effects. Despite our understanding of the mechanism of action of neurosteroids as positive allosteric modulators (PAMs) of GABA a receptors, we still do not fully understand how allopregnanolone exerts these persistent antidepressant effects. Here, we demonstrate that allopregnanolone and similar synthetic neuroactive steroid analogs, SGE-516 (tool-compound) and zuranolone (SAGE-217, investigational-compound), are capable of modulating oscillatory states across species, which we propose may contribute to long-lasting changes in behavioral states. We identified a critical role for interneurons in generating oscillations in the basolateral amygdala (BLA) and a role for delta-containing GABA a Rs in mediating the ability of neurosteroids to modulate network and behavioral states. Actions of allopregnanolone in the BLA is sufficient to alter behavioral states and enhance BLA high-theta oscillations (6-12Hz) through delta-containing GABA a receptors, a mechanism distinct from other GABA a PAMs, such as benzodiazepines. Moreover, treatment with the allopregnanolone analog SGE-516 induces long-lasting protection from chronic stress-induced disruption of network states, which correlates with improved behavioral outcomes. Our findings demonstrate a novel molecular and cellular mechanism mediating the well-established anxiolytic and antidepressant effects of neuroactive steroids.

Abstract Chronic stress is a major risk factor for psychiatric illnesses, including depression; however, the pathophysiological mechanisms whereby stress leads to mood disorders remain unclear. The recent FDA approval of antidepressants with novel mechanisms of action, like Zulresso®, a synthetic neuroactive steroid analog with molecular pharmacology similar to allopregnanolone, has spurred interest in new therapeutic targets and, potentially, novel pathophysiological mechanisms for depression. Allopregnanolone acts as a positive allosteric modulator of GABA A receptors (GABA A RS), acting preferentially at δ subunit-containing receptors (δ-GABA A RS). Accumulating clinical and preclinical evidence supports the antidepressant effects of exogenous administration of allopregnanolone and allopregnanolone analogs; however, the role of endogenous neurosteroids in the pathophysiology of depression remains unknown. Here, we examine whether altered neurosteroid signaling may contribute to behavioral deficits following chronic unpredictable stress (CUS) in mice. We first identified reductions in expression of δ-GABA A Rs, the predominant site of action of 5a-reduced neuroactive steroids, following CUS. Additionally, utilizing LC-MS/MS we discovered a decrease in levels of allopregnanolone in the BLA, but not plasma of mice following CUS, an indication of impaired neurosteroid synthesis. CRISPR knockdown the rate-limiting enzymes involved in allopregnanolone synthesis, 5α-reductase type 1 and 2, in the BLA mimicked the behavioral deficits associated with CUS in mice. Furthermore, overexpression expression of 5α-reductase type 1 and 2 in the BLA improved behavioral outcomes. Collectively, this suggests chronic stress impairs endogenous neurosteroid signaling in the BLA which is sufficient to induce behavioral deficits similar to those observed following CUS. Further, these studies suggest that the therapeutic efficacy of allopregnanolone-based treatments may be due to their ability to directly target the underlying pathophysiology of mood disorders. Therefore, targeting endogenous neurosteroidogenesis may offer a novel therapeutic strategy for the treatment of mood disorders.

Summary Epilepsy is often comorbid with psychiatric illnesses, including anxiety and depression. Despite the high incidence of psychiatric comorbidities in people with epilepsy, few studies address the underlying mechanisms. Stress can trigger both epilepsy and depression and significant accumulating evidence, from both human and animal studies, support that hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis dysfunction may contribute to the comorbidity of these two disorders 1 . Here we directly investigate the contribution of HPA axis dysfunction to epilepsy outcomes and psychiatric comorbidities. We generated a novel mouse model (KCC2/Crh mice) that lacks the K + /Cl - co-transporter, KCC2, in corticotropin-releasing hormone (CRH) neurons, which exhibit stress- and seizure-induced hyperactivation of the HPA axis. 2,3 Here we demonstrate that HPA axis dysfunction in KCC2/Crh mice is associated with increased vulnerability to behavioral deficits in chronically epileptic mice and more severe neuropathological features associated with chronic epilepsy (e.g. increased mossy fiber sprouting). Despite equivalent seizure burden, HPA axis dysfunction in these chronically epileptic mice increased the incidence of sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). Suppressing HPA axis hyperexcitability in this model using a pharmacological or chemogenetic approach decreased SUDEP incidence, supporting HPA axis dysfunction in SUDEP vulnerability. We also observed changes in neuroendocrine markers in individuals that died of SUDEP compared to people with epilepsy or individuals without a history of epilepsy. Together, these findings describe a novel, nongenetic mouse model of SUDEP which will benefit preclinical SUDEP research to gain a better understanding of the underlying pathological mechanisms contributing to SUDEP. HPA axis dysfunction increases vulnerability to psychiatric comorbidities in epilepsy and may be a risk factor for SUDEP.

Epilepsy is often comorbid with psychiatric illnesses, including anxiety and depression. Despite the high incidence of psychiatric comorbidities in people with epilepsy, few studies address the underlying mechanisms. Stress can trigger epilepsy and depression. Evidence from human and animal studies support that hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis dysfunction may contribute to both disorders as well as their comorbidity (Kanner, 2003). Here, we investigate if HPA axis dysfunction may influence epilepsy outcomes and psychiatric comorbidities. We generated a novel mouse model ( Kcc2 / Crh KO mice) lacking the K + /Cl - co-transporter, KCC2, in corticotropin-releasing hormone (CRH) neurons, which exhibit stress- and seizure-induced HPA axis hyperactivation (Melon et al., 2018). We used the Kcc2 / Crh KO mice to examine the impact on epilepsy outcomes, including seizure frequency/burden, comorbid behavioral deficits, and SUDEP risk. We found sex differences in HPA axis dysfunction's effect on chronically epileptic KCC2/Crh KO mice seizure burden, vulnerability to comorbid behavioral deficits, and SUDEP. Suppressing HPA axis hyperexcitability in this model using pharmacological or chemogenetic approaches decreased SUDEP incidence, suggesting that HPA axis dysfunction may contribute to SUDEP. Altered neuroendocrine markers were present in SUDEP cases compared to people with epilepsy or individuals without epilepsy. Together, these findings implicate HPA axis dysfunction in the pathophysiological mechanisms contributing to psychiatric comorbidities in epilepsy and SUDEP. Significance Statement Our work provides new insight into a potential novel pathophysiological mechanism contributing to psychiatric illnesses and SUDEP in epilepsy patients, implicating HPA axis dysfunction in negative outcomes associated with epilepsy. This study is the first to link HPA axis dysfunction to SUDEP risk. Chronically epileptic male mice with exaggerated HPA axis dysfunction had increased SUDEP incidence. The translational relevance of these findings is supported by neuroendocrine abnormalities observed in postmortem samples from individuals that died of SUDEP. These data suggest that neuroendocrine mechanisms should be further explored in psychiatric comorbidities in epilepsy and SUDEP risk. Further, neuroendocrine markers may be a biomarker for SUDEP risk.

Adverse childhood experiences (ACEs) are associated with numerous detriments in health, including increased vulnerability to psychiatric illnesses. Early life stress (ELS) in rodents has been shown to effectively model several of the behavioral and endocrine impacts of ACEs and has been utilized to investigate the underlying mechanisms contributing to disease. However, the precise neural mechanisms responsible for mediating the impact of ELS on vulnerability to psychiatric illnesses remain largely unknown.

Summary Noradrenergic afferents to hypothalamic corticotropin releasing hormone (CRH) neurons provide a major excitatory drive for somatic stress activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis. We showed that glucocorticoids rapidly desensitize CRH neurons to norepinephrine and suppress inflammation-induced HPA activation via a glucocorticoid receptor- and endocytosis-dependent mechanism. Here, we show that α1 adrenoreceptor (ARα1) trafficking is regulated by convergent glucocorticoid and nitric oxide synthase signaling mechanisms. Live-cell imaging of ARα1b-eGFP-expressing hypothalamic cells revealed rapid corticosterone-stimulated redistribution of internalized ARα1 from rapid recycling endosomes to late endosomes and lysosomes via a nitrosylation-regulated mechanism. Proximity assay demonstrated interaction of glucocorticoid receptors with ARα1b and β-arrestin, and showed corticosterone blockade of norepinephrine-stimulated ARα1b/β-arrestin interaction, which may prevent ARα1b from entering the rapid recycling endosomal pathway. These findings demonstrate a rapid glucocorticoid regulation of G protein-coupled receptor trafficking and provide a molecular mechanism for rapid glucocorticoid desensitization of noradrenergic signaling in CRH neurons.

Abstract Motivated behaviors, such as social interactions, are governed by the interplay between mesocorticolimbic structures, such as the ventral tegmental area (VTA), basolateral amygdala (BLA), and medial prefrontal cortex (mPFC). Adverse childhood experiences and early life stress (ELS) can impact these networks and behaviors, which is associated with increased risk for psychiatric illnesses. While it is known that the VTA projects to both the BLA and mPFC, the influence of these inputs on local network activity which govern behavioral states – and whether ELS impacts VTA-mediated network communication – remains unknown. Our study demonstrates that VTA inputs influence BLA oscillations and mPFC activity, and that ELS weakens the ability of the VTA to coordinate BLA network states, likely due to ELS-induced impairments in dopamine signaling between the VTA and BLA. Consequently, ELS mice exhibit increased social avoidance, which can be recapitulated in control mice by inhibiting VTA-BLA communication. These data suggest that ELS impacts social reward via the VTA-BLA dopamine network.

Noradrenergic afferents to corticotropin releasing hormone (CRH) neurons of the hypothalamic paraventricular nucleus (PVN) provide a major excitatory drive to the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis via α1 adrenoreceptor activation. The ascending noradrenergic afferents are recruited preferentially by physiological, rather than psychological, stress modalities. Glucocorticoids secreted in response to HPA activation feed back onto the hypothalamus to negatively regulate the HPA axis, providing a critical autoregulatory constraint that prevents glucocorticoid overexposure. Whether differential negative feedback mechanisms target stress modality-specific HPA activation is not known. Here, we reveal a desensitization of the α1 adrenoreceptor activation of the HPA axis following acute stress that is mediated by rapid glucocorticoid regulation of adrenoreceptor trafficking. Prior stress desensitized the HPA axis to subsequent physiological, but not psychological, stress. Our findings demonstrate rapid glucocorticoid suppression of adrenoreceptor signaling in CRH neurons that is specific to physiological stress activation, and reveal, therefore, a rapid, modality-selective glucocorticoid feedback mechanism.

Stress is a common seizure trigger that has been implicated in worsening epilepsy outcomes. The neuroendocrine response to stress is mediated by the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and HPA axis dysfunction worsens epilepsy outcomes, increasing seizure burden, behavioral comorbidities, and risk for sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP) in mice. Early life stress (ELS) reprograms the HPA axis into adulthood, impacting both the basal and stress-induced activity. Thus, we propose that ELS may influence epilepsy outcomes by influencing the function of the HPA axis. To test this hypothesis, we utilized the maternal separation paradigm and examined the impact on seizure susceptibility. We show that ELS exerts a sex dependent effect on seizure susceptibility in response to acute administration of the chemoconvulsant, kainic acid, which is associated with an altered relationship between seizure activity and HPA axis function. To further examine the impact of ELS on epilepsy outcomes, we utilized the intrahippocampal kainic acid model of chronic epilepsy in mice previously exposed to maternal separation. We find that the relationship between corticosterone levels and the extent of epileptiform activity is altered in mice subjected to ELS. We demonstrate that ELS impacts behavioral outcomes associated with chronic epilepsy in a sex-dependent manner, with females being more affected. We also observe reduced mortality (presumed SUDEP) in female mice subjected to ELS, consistent with previous findings suggesting a role for HPA axis dysfunction in SUDEP risk. These data demonstrate for the first time that ELS influences epilepsy outcomes and suggest that previous life experiences may impact the trajectory of epilepsy.

Abstract The basolateral amygdala (BLA) has been implicated in mediating both fear and reward learning. Parvalbumin interneurons (PVs) in the BLA have previously been shown to contribute to BLA oscillatory states integral to fear expression, but whether BLA oscillatory states and PV interneurons also contribute to reward learning is unknown and critical to our understanding of reward processing. Local field potentials in the BLA were collected as animals consumed a sucrose reward, where prominent changes in the beta band (15-30 Hz) emerged with reward experience. Rhythmic optogenetic stimulation of PV interneurons to entrain the BLA network to 20Hz during consumption of one bottle during a two-bottle choice test produced a robust bottle preference. Finally, to demonstrate that PV activity is necessary for reward value use, PVs were chemogenetically targeted and inhibited following outcome devaluation, rendering those animals incapable of using updated reward value information to guide their behavior. Taken together, these experiments provide novel information regarding the physiological signatures of reward learning while highlighting the importance of PV interneurons in reward learning. This work builds upon the field’s established knowledge of PV involvement in fear expression and provides evidence that PV orchestration of unique BLA network states is involved in both learning types.