Abstract α-Synuclein inclusions are a pathological hallmark of several neurodegenerative diseases. Although it has been demonstrated a relationship between fibril polymorphism and different pathologies, the molecular origins of polymorphism are not understood. Employing biophysical approaches, we revealed that the conformational state of the monomeric αSyn is responsible for fibril polymorphism: αSyn adopts specific conformations at high NaCl that produce rod fibrils, and different conformations at low NaCl that generate twisted fibrils. Using NMR, we found that the high NaCl conformations establish a polar interaction between the initial part of the NAC region and a wide section of the C-terminus domain. These high NaCl conformations can be commonly promoted by changes in the chemical environment, like NaCl, the presence of Ca 2+ or cellular components, like endotoxins, that alter the interaction NAC/C-terminus domain. Our results provide mechanistic insights that explain how the behavior of the C-terminus domain imparts polymorphism during the fibril formation. Significance Statement The accumulation of the protein α-Synuclein into amyloid aggregates in the brain is a key characteristic of neurodegenerative disorders like Parkinson’s disease and multiple system atrophy. Intensive research has demonstrated that structurally different amyloid fibrils are related to the development of different diseases; however, the molecular mechanisms that originate such fibril diversity from the same protein remain unknown. In this work, we discovered that the conformational state of the monomeric αSyn, regulated by an intramolecular polar interaction NAC region/C-terminus domain, is crucial for the generation of different fibrils. Our results represent the monomeric molecular events behind the diversity of fibrils and open the conformational state of αSyn as a target to understand how the fibrils get formed in the brain.

Protein tyrosine phosphatase receptor type Z (PTPRZ) has two receptor isoforms (PTPRZ-A and -B) containing tandem PTP-D1 and -D2 domains intracellularly, with only D1 being active. Pleiotrophin (PTN) binding to the extracellular region of PTPRZ leads to the inactivation of PTPase, thereby inducing oligodendrocyte precursor cell (OPC) differentiation and myelination in the CNS. However, the mechanisms responsible for the ligand-induced inactivation of PTPRZ remain unclear. We herein revealed that the crystal structure of the intracellular region of PTPRZ (PTPRZ-ICR) showed the "head-to-toe"-type dimer conformation, with D2 masking the catalytic site of D1. Mass spectrometry (MS) revealed that PTPRZ-ICR proteins remained in monomer-dimer equilibrium in aqueous solution, and a substrate-derived inhibitory peptide or competitive inhibitor (SCB4380) specifically bound to the monomer form in a 1:1 stoichiometric ratio, supporting the "head-to-toe dimerization" model for inactivation. A D2 deletion (ΔD2) or dimer interface mutation (DDKK) disrupted dimer formation, while the binding of SCB4380 was maintained. Similar to wild-type PTPRZ-B, monomer-biased PTPRZ-B-ΔD2 and PTPRZ-B-DDKK mutants efficiently dephosphorylated p190RhoGAP at Tyr-1105 when co-expressed in BHK-21 cells. The catalytic activities of these mutants were not suppressed by a treatment with PTN, but were inhibited by the cell-permeable PTPase inhibitor NAZ2329. The PTN treatment did not enhance OPC differentiation in primary cultured glial cells prepared from ΔD2 or catalytically-inactive CS mutant knock-in mice. Our results indicate that PTN-induced PTPRZ inactivation is attained by dimer formation of the intracellular tandem PTP domains in the head-to-toe configuration, which is physiologically relevant to the control of OPC differentiation in vivo.

The adeno-associated virus (AAV) vector is one of the most advanced platforms for gene therapy because of its low immunogenicity and non-pathogenicity. The concentrations of both AAV vector empty particles, which do not contain DNA and do not show any efficacy, and AAV vector full particles (FPs), which contain DNA, are important quality attributes. In this study, a dual fluorescence-linked immunosorbent assay (dFLISA), which uses two fluorescent dyes to quantify capsid and genome titers in a single analysis, was established. In dFLISA, capture of AAV particles, detection of capsid proteins, and release and detection of the viral genome are performed in the same well. We demonstrated that the capsid and genomic titers determined by dFLISA were comparable with those of analytical ultracentrifugation. The FP ratios determined by dFLISA were in good agreement with the expected values. In addition, we showed that dFLISA can quantify the genomic and capsid titers of crude samples. dFLISA can be easily modified for measuring other AAV vector serotypes and AAV vectors with different genome lengths. These features make dFLISA a valuable tool for the future development of AAV-based gene therapies.

Abstract Immunoglobulin G (IgG) is a molecule that plays an important role in biological defense; IgG molecules have been applied as drugs due to their high specificity for antigens and their ability to activate immunity via effector molecules on immune cells. On the other hand, the flexibility of the hinge region makes it difficult to apply conventional structural biology approaches due to its dynamic conformational changes, and the mechanism of action of the molecule as a whole has not been elucidated. Here, we introduced a deletion amino acid mutation in the hinge region to elucidate the role of the hinge region and its effect on the structure and function of the IgG molecule. Deletion of Pro230 resulted in the formation of a half-molecular in which the interaction between heavy chains was lost. We elucidated the mechanism of half-IgG formation by structural analysis using nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and by disulfide quantification using peptide mapping using LC-MS/MS. For this purpose, a new NMR stable isotope labeling method was introduced. Finally, cell assay revealed that the IgG half-molecules have specific FcγRI-mediated activity. This report provides new insights into the higher-order structure formation of IgG molecules and is expected to contribute to the elucidation of the molecular basis of the Fcγ receptor-mediated activation mechanism of the immune system.

Abstract LI-cadherin is a member of the cadherin superfamily. LI-cadherin mediates Ca 2+ -dependent cell-cell adhesion by forming a homodimer. A previous study reported two single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the LI-cadherin-coding gene ( CDH17 ). These SNPs correspond to the amino acid changes of Lys115 to Glu and Glu739 to Ala. Patients with colorectal cancer carrying these SNPs are reported to have a higher risk of lymph node metastasis than patients without the SNPs. Although proteins associated with metastasis have been identified, the molecular mechanisms underlying the functions of these proteins remain unclear, making it difficult to develop effective strategies to prevent metastasis. In this study, we employed biochemical assays and molecular dynamics (MD) simulations to elucidate the molecular mechanisms by which the amino acid changes caused by SNPs in the LI-cadherin-coding gene increase the risk of cancer metastasis. Cell aggregation assays showed that the amino acid changes weakened the LI-cadherin-dependent cell-cell adhesion. In vitro assays demonstrated a decrease in homodimerization tendency due to the mutation of Lys115, and MD simulations suggested an alteration in the intramolecular hydrogen bond network due to the amino acid change. Taken together, our results indicate that the increased risk of lymph node metastasis is due to weakened cell-cell adhesion caused by the decrease in homodimerization tendency.

Abstract LI-cadherin is a member of the cadherin superfamily, which encompasses a group of Ca 2+ -dependent cell adhesion proteins. The expression of LI-cadherin is observed on various types of cells in the human body, such as normal small intestine and colon cells, and gastric cancer cells. Because its expression is not observed on normal gastric cells, LI-cadherin is a promising target for gastric cancer imaging. However, since the cell adhesion mechanism of LI-cadherin has remained unknown, rational design of therapeutic molecules targeting this cadherin has been hampered. Here, we have studied the homodimerization mechanism of LI-cadherin. We report the crystal structure of the LI-cadherin EC1-4 homodimer. The EC1-4 homodimer exhibited a unique architecture different from that of other cadherins reported so far. The crystal structure also revealed that LI-cadherin possesses a noncanonical calcium ion-free linker between EC2 and EC3. Various biochemical techniques and molecular dynamics (MD) simulations were employed to elucidate the mechanism of homodimerization. We also showed that the formation of the homodimer observed by the crystal structure is necessary for LI-cadherin-dependent cell adhesion by performing cell aggregation assay.