Group A streptococci have evolved multiple strategies to evade human antibodies, making it challenging to create effective vaccines or antibody treatments. Here, we have generated antibodies derived from the memory B cells of an individual who had successfully cleared a group A streptococcal infection. The antibodies bind with high affinity in the central region of the surface-bound M protein. Such antibodies are typically non-opsonic. However, one antibody could effectively promote vital immune functions, including phagocytosis and in vivo protection. Remarkably, this antibody primarily interacts through a bivalent dual-Fab cis mode, where the Fabs bind to two distinct epitopes in the M protein. The dual-Fab cis binding phenomenon is conserved across different groups of M types. In contrast, other antibodies binding with normal single-Fab mode to the same region can not bypass the M protein’s virulent effects. A broadly binding, protective monoclonal antibody could be a candidate for anti-streptococcal therapy. Our findings highlight the concept of dual-Fab cis binding as a means to access conserved, and normally non-opsonic regions, for protective antibody targeting.

Antibodies are central to the immune response against microbes. We have previously generated a protective IgG1 monoclonal antibody targeting the M protein, a critical virulence factor of Streptococcus pyogenes. Here, we generated this antibody in all human IgG subclasses and evaluated their function. Despite significantly reduced binding, the IgG3 subclass antibody demonstrated remarkably enhanced opsonic function. We hypothesized that increased Fc flexibility could explain this improved efficacy. We engineered a hybrid IgG subclass antibody, IgGh, containing the backbone of IgG1 with the hinge of IgG3, leaving the Fabs unchanged. The IgGh maintained a similar binding ability as IgG1 while gaining the strong opsonic function seen with IgG3. Molecular dynamics simulations of the different antibodies showed altered IgG Fab-antigen interactions, reflecting the differences observed in affinity. More importantly, when the antibodies were bound to the antigen, the simulations showed that the Fc of both IgGh and IgG3 exhibited extensive movement in 3D space relative to the M protein. The increased flexibility of IgGh directly translated to enhanced opsonic function and significantly increased the protection against infection with Streptococcus pyogenes in mice. Our findings demonstrate how altering Fc flexibility can improve Fc-mediated opsonic function and how modifications in the constant domain can regulate Fab-antigen interactions. In addition, the enhanced in vivo function of a more flexible IgG provides new therapeutic opportunities for monoclonal antibodies.

An important element of antibody-guided vaccine design is the use of neutralizing/opsonic monoclonal antibodies to define protective epitopes in their native three-dimensional conformation. Here, we demonstrate a multi-modal mass spectrometry-based strategy for in-depth characterization of antigen-antibody complexes to enable the identification of protective epitopes using the cytolytic exotoxin Streptolysin O (SLO) from Streptococcus pyogenes as a showcase. We first discovered a monoclonal antibody with an undisclosed sequence capable of neutralizing SLO-mediated cytolysis. The amino acid sequence of both the antibody light and the heavy chain was determined using mass spectrometry-based de novo sequencing, followed by chemical crosslinking mass spectrometry to generate distance constraints between the antibody fragment antigen-binding region and SLO. Subsequent integrative computational modeling revealed a discontinuous epitope located in Domain 3 of SLO that was experimentally validated by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry and reverse-engineering of the targeted epitope. The results show that the antibody inhibits SLO-mediated cytolysis by binding to a discontinuous epitope in Domain 3, likely preventing oligomerization and subsequent secondary structure changes critical for pore-formation. The epitope is highly conserved across >98% of the characterized S. pyogenes isolates, making it an attractive target for antibody-based therapy and vaccine design against severe streptococcal infections.

Abstract Streptococcus pyogenes is a human-specific bacterial pathogen that produces several proteins that exploit the plasminogen (PLG)-plasmin (PLM) fibrinolysis system to dismantle blood clots and to facilitate spread and survival within the host. In this study, we explored the interactions between streptolysin O (SLO), a key cytolytic toxin produced by S. pyogenes , and human plasma proteins using affinity-enrichment mass spectrometry. SLO binds specifically to PLG, and this interaction accelerates the conversion of PLG to PLM by tissue-type plasminogen activator (tPA). To further investigate the molecular detail of the PLG-SLO interaction, we employed hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry combined with targeted cross-linking mass spectrometry, uncovering that SLO binding induces local conformational shifts in PLG. These changes lead to the formation of a stabilized intermediate PLG-SLO complex that becomes significantly more sensitive to proteolytic processing by tPA. Our findings reveal a conserved moonlighting pathomechanistic role for SLO extending beyond the well characterized cytolytic activity. Additionally, the work underscores the diversity of functional proteomics in identifying and clarifying new host-pathogen interactions.

Abstract Generating and analyzing overlapping peptides through multienzymatic digestion is an efficient procedure for de novo protein using from bottom-up mass spectrometry (MS). Despite improved instrumentation and software, de novo MS data analysis remains challenging. In recent years, deep learning models have represented a performance breakthrough. Incorporating that technology into de novo protein sequencing workflows require machine-learning models capable of handling highly diverse MS data. In this study, we analyzed the requirements for assembling such generalizable deep learning models by systematically varying the composition and size of the training set. We assessed the generated models’ performances using two test sets composed of peptides originating from the multienzyme digestion of samples from various species. The peptide recall values on the test sets showed that the deep learning models generated from a collection of highly N- and C-termini diverse peptides generalized 76% more over the termini-restricted ones. Moreover, expanding the training set’s size by adding peptides from the multienzymatic digestion with five proteases of several species samples led to a 2-3 fold generalizability gain. Furthermore, we tested the applicability of these multienzyme deep learning (MEM) models by fully de novo sequencing the heavy and light monomeric chains of five commercial antibodies (mAbs). MEM models extracted over 10000 matching and overlapped peptides across six different proteases mAb samples, achieving a 100% sequence coverage for 8 of the ten polypeptide chains. We foretell that the MEM models’ proven improvements to de novo analysis will positively impact several applications, such as analyzing samples of high complexity, unknown nature, or the peptidomics field.