Summary Neurodegenerative diseases are increasingly prevalent in the aging population, yet currently no disease-modifying treatments are available. Increasing the expression of the cold-shock protein, RBM3, through therapeutic hypothermia is remarkably neuroprotective, but cooling poses a health risk itself, strongly limiting its clinical application. Selective upregulation of RBM3 at normothermia thus holds immense therapeutic potential. Here we identify a poison exon within the RBM3 gene that is solely responsible for cold-induced RBM3 expression. Genetic removal or ASO-mediated manipulation of this exon yields high RBM3 levels independent of cooling. Notably, a single administration of ASO to exclude the poison exon, using FDA-approved chemistry, results in long-lasting increase of RBM3 expression in mouse brains. In prion-diseased mice, this treatment leads to remarkable neuroprotection, with prevention of neuronal loss and spongiosis despite high levels of prion protein. RBM3-inducing ASOs could thus broadly deliver protection in humans in conditions ranging from acute brain injury to Alzheimer’s disease. One sentence summary Inducing cold shock protein RBM3 by modulating its alternative splicing at normothermia is neuroprotective in vivo

The question whether interference with the ubiquitous splicing machinery can lead to cell-type specific perturbation of cellular function is addressed here by T cell specific ablation of the general U5 snRNP assembly factor CD2BP2/U5–52K. This protein defines the family of nuclear GYF domain containing proteins that are ubiquitously expressed in eukaryotes with essential functions ascribed to early embryogenesis and organ function. Abrogating CD2BP2/U5–52K in T cells, allows us to delineate the consequences of splicing machinery interferences for T cell development and function. Increased T cell lymphopenia and T cell death are observed upon depletion of CD2BP2/U5–52K. A substantial increase in exon skipping coincides with the observed defect in the proliferation/differentiation balance in the absence of CD2BP2/U5–52K. Prominently, skipping of exon 7 in Mdm4 is observed, coinciding with upregulation of pro-apoptotic gene expression profiles upon CD2BP2/U5–52K depletion. Furthermore, we observe enhanced sensitivity of naïve T cells compared to memory T cells to changes in CD2BP2/U5–52K levels, indicating that depletion of this general splicing factor leads to modulation of T cell homeostasis. Given the recent structural characterization of the U5 snRNP and the crosslinking mass spectrometry data given here, design of inhibitors of the U5 snRNP conceivably offers new ways to manipulate T cell function in settings of disease.

The role of general splicing in endoplasmic reticulum (ER)-proteostasis remains poorly understood. Here, we identify SNRPB, a component of the spliceosome, as a novel regulator of export from the ER. Mechanistically, SNRPB regulates the splicing of components of the ER export machinery, including Sec16A, a regulator of ER exit sites. Loss of function of SNRPB is causally linked to cerebro-costo-mandibular syndrome (CCMS), a genetic disease characterized by bone defects. We show that heterozygous deletion of SNRPB in mice resulted in intracellular accumulation of type-1 collagen as well as bone defects reminiscent of CCMS. Silencing SNRPB inhibited osteogenesis in vitro, which could be rescued by overexpression of Sec16A. This indicates that the role of SNRPB in osteogenesis is linked to its effects on ER export. Finally, we show that SNRPB is a target for the unfolded protein response (UPR), which supports a mechanistic link between the spliceosome and ER-proteostasis. Our work highlights SNRPB as a novel node in the proteostasis network, shedding light on CCMS pathophysiology.

The family of CDC2-like kinases (CLKs) play a crucial role in regulating alternative splicing (AS), a process fundamental to eukaryotic gene expression and adaptation. Of particular interest, these enzymes exhibit unique responsiveness to minor temperature shifts, enabling them to modulate AS accordingly. Dysregulated CLK expression is linked to a wide variety of human diseases, establishing them as promising therapeutic targets. Despite the importance of CLKs, limited research has explored the genetic and functional diversification of this gene family. This report investigates the evolutionary origins, diversification, and functional implications of CLKs across major eukaryotic lineages through phylogenetic and structural comparisons. Our data demonstrate these kinases are prevalent throughout eukaryotes, with the original gene (which shares orthology to human CLK2), dating back to the Last Eukaryotic Common Ancestor. We identified three key duplication events in vertebrates, highlighting how this gene family has expanded and diversified in complex metazoans. Despite two instances of CLK paralog loss in vertebrate lineages, CLKs remain prevalent throughout metazoans, suggesting they are essential for complex eukaryotic life. Structural comparisons across diverse eukaryotes demonstrate kinase domain conservation, which is in line with their maintained function in AS regulation. While the N-terminal region of CLK family members varies significantly in amino acid sequence, the function of this domain to regulate phosphorylation of AS factors is conserved, albeit in a species-specific manner. CLKs exhibit unique thermo-sensitive properties across diverse species, challenging conventional enzymatic behaviour. This temperature regulation, mediated by their kinase activation segment, is characterised by increased activity at lower physiological temperatures. The conservation of this structure, and a thermo-sensitive amino acid motif within it, suggests this was an ancient adaptation for responding to environmental cues. Species-specific temperature profiles highlight the adaptive evolution of CLKs, enabling organisms to thrive in diverse environmental conditions including extreme temperatures. Our analysis expands the understanding of CLK biology across diverse eukaryotes and connects insights from model organisms to human biology.

Abstract Regulation and functionality of species-specific alternative splicing has remained enigmatic to the present date. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase IIβ (CaMKIIβ) is expressed in several splice variants and plays a key role in learning and memory. Here, we identify and characterize several primate-specific CAMK2B splice isoforms, which show altered kinetic properties and changes in substrate specificity. Furthermore, we demonstrate that primate-specific Camk2β alternative splicing is achieved through branch point weakening during evolution. We show that reducing branch point and splice site strengths during evolution globally renders constitutive exons alternative, thus providing a paradigm for cis -directed species-specific alternative splicing regulation. Using CRISPR/Cas9 we introduced a weaker human branch point into the mouse genome, resulting in human-like CAMK2B splicing in the brain of mutant mice. We observe a strong impairment of long-term potentiation in CA3-CA1 synapses of mutant mice, thus connecting branch point-controlled, species-specific alternative splicing with a fundamental function in learning and memory.

Mammalian body temperature oscillates with the time of the day and is altered in diverse pathological conditions. We recently identified a body temperature-sensitive thermometer-like kinase, which alters SR protein phosphorylation and thereby globally controls alternative splicing (AS). AS can generate mRNA variants containing premature termination codons, which are degraded by nonsense-mediated decay (NMD). Here we show extensive coupling of body temperature-controlled AS to NMD, leading to global control of temperature-dependent gene expression (GE). Temperature-controlled NMD-inducing splicing events are evolutionarily conserved and pervasively found within RNA-binding proteins, including most SR proteins. NMD-inducing exons are essential for rhythmic GE of SR proteins and have a global role in establishing temperature-dependent rhythmic GE profiles, both, in mammals under circadian body temperature cycles and in plants in response to ambient temperature changes. Together, these data identify body temperature-driven AS-NMD as an evolutionary ancient, core clock-independent mechanism to generate rhythmic GE.

Summary Mammals tightly regulate their core body temperature, yet how cells sense and respond to small temperature changes at the molecular level remains incompletely understood. Here, we discover a significant enrichment of RNA G-quadruplex (rG4) motifs around splice sites of cold-repressed exons. These thermosensing RNA structures, when stabilized, mask splice sites, reducing exon inclusion. Focusing on cold-induced neuroprotective RBM3, we demonstrate that rG4s near splice sites of a cold-repressed poison exon are stabilized at low temperatures, leading to exon exclusion. This enables evasion of nonsense-mediated decay, increasing RBM3 expression at cold. Additionally, increasing intracellular potassium concentration stabilizes rG4s and enhances RBM3 expression, leading to RBM3-dependent neuroprotection in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Our findings unveil a mechanism how mammalian RNAs directly sense temperature and potassium perturbations, integrating them into gene expression programs. This opens new avenues for treating diseases arising from splicing defects and disorders benefiting from therapeutic hypothermia. Highlights rG4s are enriched near splice sites of cassette exons repressed upon cold shock rG4s act as RNA thermometers in mammals by controlling accessibility of splice sites rG4 stability mediates temperature-dependent RBM3 expression ex vivo and in vivo Stabilizing rG4s in RBM3 exon 3a reduces brain damage in subarachnoid hemorrhage Graphical abstract Here is a refined model of RNA G-quadruplexes acting as evolutionarily conserved thermo- and potassium sensors, modulating alternative splicing in mammals. RNA G-quadruplexes (rG4s) function as reversible temperature sensors, impacting alternative splicing dynamics. In low temperatures or high potassium conditions, rG4s can mask surrounding splice sites, rendering these sites inaccessible, thereby promoting exon skipping. Conversely, at high temperatures or under low potassium conditions, rG4s become destabilized, allowing splice sites to be exposed, and facilitating efficient exon inclusion. RBM3, a well-known cold-induced protein with neuroprotective functions, harbors a poison exon with rG4s around splice sites, that, upon inclusion, triggers NMD (non-sense mediated decay) of the RBM3 mRNA. Under low temperatures or high potassium conditions, rG4s shield the splice sites, leading to poison exon skipping and increased RBM3 expression. Stabilization of these rG4s through increased K + promotes poison exon skipping, enabling escape from NMD, and ultimately elevating RBM3 expression. Notably, 4-AP, a clinically used pan voltage-gated potassium channel blocker, protects against neuronal damage in a subarachnoid hemorrhage mouse model in an RBM-dependent manner. (ISS: intronic splicing silencer, ESE: exon splicing enhancer, ACA: anterior cerebral artery, MCA: middle cerebral artery, PPA: pterygopalatine artery, ICA: internal carotid artery, ECA: external carotid artery, CCA: common carotid artery)