The wild-type Caenorhabditis elegans nematode ages rapidly, undergoing development, senescence, and death in less than 3 weeks. In contrast, mutants with reduced activity of the gene daf-2, a homolog of the insulin and insulin-like growth factor receptors, age more slowly than normal and live more than twice as long. These mutants are active and fully fertile and have normal metabolic rates. The life-span extension caused by daf-2 mutations requires the activity of the gene daf-16. daf-16 appears to play a unique role in life-span regulation and encodes a member of the hepatocyte nuclear factor 3 (HNF-3)/forkhead family of transcriptional regulators. In humans, insulin down-regulates the expression of certain genes by antagonizing the activity of HNF-3, raising the possibility that aspects of this regulatory system have been conserved.

Abstract To maintain potassium homeostasis, the kidney’s distal convoluted tubule (DCT) converts small changes in blood [K + ] into robust effects on salt reabsorption. This process requires NaCl cotransporter (NCC) activation by WNK kinases. During hypokalemia, the Kidney-Specific WNK1 isoform (KS-WNK1) scaffolds the DCT-expressed WNK signaling pathway within biomolecular condensates of unknown function termed WNK bodies. Here, we show that KS-WNK1 amplifies the dynamic range of NCC activity in response to potassium imbalance, in part via WNK bodies. Targeted condensate disruption traps the WNK pathway, causing renal salt-wasting that is more pronounced in females. In humans, WNK bodies accumulate as plasma potassium falls below 4.0mmol/L, suggesting avid condensate-mediated salt reabsorption even when [K + ] is low-normal. These data identify WNK bodies as signal amplifiers that mediate tubular potassium responsiveness, nephron sexual dimorphism, and blood pressure salt-sensitivity. Our results illustrate how condensate specialization can optimize a mammalian physiologic stress response that impacts human health.

ABSTRACT Despite the enormous harms of alcohol use disorders (AUDs), many mechanisms, as well as effective prevention or treatment strategies remain elusive. Genetic factors dictate a majority of AUD risk. These risk factors can manifest as reduced naïve sensitivity to alcohol’s intoxicating effects and increased functional tolerance, i.e., brain-mediated decreases in sensitivity upon repeat exposure. The underlying neurobiology of how AUD-associated genes alter these endophenotypes remains poorly understood. Genes implicated in AUDs include epigenetic modifiers, such as histone demethylases, including Kdm3 . We previously showed that whole-body and neuronal Kdm3 strongly affect ethanol sensitivity and tolerance in Drosophila . Here, we investigate the mechanisms of these effects, and, by extension, mechanisms of sensitivity and tolerance. RNA-seq and pathway analysis on Kdm3 KO flies revealed disproportionate upregulation of genes involved in amino acid metabolism, including 1-carbon pathways. We show that acute amino acid feeding modulates sensitivity and tolerance in a Kdm3 -dependent manner. Global manipulation of 1-carbon genes, especially glycine N -methyltransferase ( Gnmt ), glycine decarboxylase ( Gldc ), and sarcosine dehydrogenase ( Sardh ), alters alcohol sensitivity and tolerance. These changes in alcohol responses are likely mediated by global glycine levels (a substrate of these enzymes) rather than by 1-carbon input. Conversely, neuronal manipulations of 1-carbon pathways change alcohol sensitivity and tolerance in a pattern that suggests a mechanism through S -adenosyl methionine (SAM), a 1-carbon metabolite that is the universal methyl donor required for epigenetic methylation. Increasing SAM production specifically in glutamatergic neurons increases sensitivity and tolerance. Together, these findings reveal distinct mechanisms affecting alcohol sensitivity and tolerance globally (via glycine) and neuronally (via SAM), thus revealing an important and complex role of 1-carbon metabolism in mediating AUD phenotypes.

Abstract Genetic variation contributes to heterogeneity in the prevalence of complex disorders such as addiction. The genetic risk for developing a substance use disorder can vary between drugs. The estimated heritability rate of cocaine addiction is 72%, higher than any other drug. Despite recognition of this significant genetic component, little is known about the specific genes and mechanisms that lead to the development of cocaine addiction. Drosophila is an effective model organism for identifying the genes that underlie complex behaviors, including addiction. While Drosophila exposed to cocaine display features of intoxication similar to those observed in mammals, there is currently no model of cocaine self-administration in flies. Because cocaine is a natural insecticide, we wondered if Drosophila might naively avoid it through bitter chemosensory detection. To answer this question, we performed cocaine consumption and preference assays comparing wild-type flies and bitter-taste mutants. Our results demonstrate that Drosophila detect and avoid cocaine through bitter sensing gustatory neurons, and that this process requires gustatory receptor 66a (Gr66a). Additionally, we identify a peripheral mechanism of avoidance through cocaine detection with Drosophila legs. Our findings reveal that preingestive mechanisms of toxin detection play a significant role in Drosophila cocaine avoidance and provide evidence that disrupting gustatory perception of cocaine is essential for self-administration and, therefore, developing a model of self-administration in Drosophila .

ABSTRACT Background Gene regulation is critical for proper cellular function. Next-generation sequencing technology has revealed the presence of regulatory networks that regulate gene expression and essential cellular functions. Studies investigating the epigenome have begun to uncover the complex mechanisms regulating transcription. Assay for transposase-accessible chromatin by sequencing (ATAC-seq) is quickly becoming the assay of choice for many epigenomic investigations. However, whether intervention-mediated changes in accessible chromatin determined by ATAC-seq can be harnessed to generate intervention-inducible reporter constructs has not been systematically assayed. Results We used the insulin signaling pathway as a model to investigate chromatin regions and gene expression changes using ATAC- and RNA-seq in insulin-treated Drosophila S2 cells. We found correlations between ATAC- and RNA-seq data, especially when stratifying differentially-accessible chromatin regions by annotated feature type. In particular, our data demonstrated a strong correlation between chromatin regions annotated to distal promoters (1-2 kb from the transcription start site) and downstream gene expression. We cloned candidate distal promoter regions upstream of luciferase and demonstrate insulin-inducibility of several of these reporters. Conclusions Insulin-induced chromatin accessibility determined by ATAC-seq reveals enhancer regions that drive insulin-inducible reporter gene expression.

The mitochondrial enzyme L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (L2HGDH) regulates the abundance of L-2-hydroxyglutarate (L-2HG), a potent signaling metabolite capable of influencing chromatin architecture, mitochondrial metabolism, and cell fate decisions. Loss of L2hgdh activity in humans induces ectopic L-2HG accumulation, resulting in neurodevelopmental defects, altered immune cell function, and enhanced growth of clear cell renal cell carcinomas. To better understand the molecular mechanisms that underlie these disease pathologies, we used the fruit fly Drosophila melanogaster to investigate the endogenous functions of L2hgdh. Our studies revealed that while L2hgdh is not essential for growth or viability under standard culture conditions, L2hgdh mutants are hypersensitive to hypoxia and expire during the reoxygenation phase with severe disruptions of mitochondrial metabolism. Moreover, we find that the fly renal system (Malpighian tubules; MTs) is a key site of L2hgdh activity, as L2hgdh mutants that express a rescuing transgene within the MTs survive hypoxia treatment and exhibit normal levels of mitochondrial metabolites. We also demonstrate that even under normoxic conditions, L2hgdh mutant MTs experience significant metabolic stress and are sensitized to aberrant growth upon Egfr activation. Overall, our findings present a model in which renal L2hgdh activity limits systemic L-2HG accumulation, thus indirectly regulating the balance between glycolytic and mitochondrial metabolism, enabling successful recovery from hypoxia exposure, and ensuring renal tissue integrity.

ABSTRACT The mitochondrial enzyme L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (L2HGDH) regulates the abundance of L-2-hydroxyglutarate (L-2HG), a potent signaling metabolite capable of influencing chromatin architecture, mitochondrial metabolism, and cell fate decisions. Loss of L2hgdh activity in humans induces ectopic L-2HG accumulation, resulting in neurodevelopmental defects, altered immune cell function, and enhanced growth of clear cell renal cell carcinomas. To better understand the molecular mechanisms that underlie these disease pathologies, we used the fruit fly Drosophila melanogaster to investigate the endogenous functions of L2hgdh. Our studies revealed that while L2hgdh is not essential for growth or viability under standard culture conditions, L2hgdh mutants are hypersensitive to hypoxia and expire during the reoxygenation phase with severe disruptions of mitochondrial metabolism. Moreover, we find that the fly renal system (Malpighian tubules; MTs) is a key site of L2hgdh activity, as L2hgdh mutants that express a rescuing transgene within the MTs survive hypoxia treatment and exhibit normal levels of mitochondrial metabolites. We also demonstrate that even under normoxic conditions, L2hgdh mutant MTs experience significant metabolic stress and are sensitized to aberrant growth upon Egfr activation. Overall, our findings present a model in which renal L2hgdh activity limits systemic L-2HG accumulation, thus indirectly regulating the balance between glycolytic and mitochondrial metabolism, enabling successful recovery from hypoxia exposure, and ensuring renal tissue integrity.

Proper regulation of feeding is important for an organism's well-being and survival. Food intake in Drosophila can be determined in a number of ways, including by measuring the time a fly's proboscis interacts with a food source in the fly liquid-food interaction counter (FLIC). Here, we show that electrical current flowing through flies during this interaction is aversive and leads to a reduction in food intake. Based on the FLIC, we engineer a novel assay, the fly liquid-food electroshock assay (FLEA), which allows for current adjustments for each feeding well. Using the FLEA, we show that both external incentives as well as internal motivational state can serve as drivers for flies to overcome higher current (electric shock) to obtain superior food. Unlike similar assays in which bitterness is the aversive stimulus for the fly to overcome, we show that current perception is not discounted as flies become more food-deprived. The FLEA is therefore a novel assay to accurately measure incentive motivation in Drosophila. Using the FLEA, we also show that neuropeptide F is required for proper perception or processing of an electroshock, a novel function for this neuropeptide involved in processing of external and internal stimuli.

Summary The Drosophila brain contains tens of thousands of distinct cell types. Thousands of different transgenic lines reproducibly target specific neuron subsets, yet most still express in several cell types. Furthermore, most lines were developed without a priori knowledge of where the transgenes would be expressed. To aid in the development of cell type-specific tools for neuronal identification and manipulation, we developed an iterative assay for transposase-accessible chromatin (ATAC) approach. Open chromatin regions (OCRs) enriched in neurons, compared to whole bodies, drove transgene expression preferentially in subsets of neurons. A second round of ATAC-seq from these specific neuron subsets revealed additional enriched OCR2s that further restricted transgene expression within the chosen neuron subset. This approach allows for continued refinement of transgene expression, and we used it to identify neurons relevant for sleep behavior. Furthermore, this approach is widely applicable to other cell types and to other organisms.

ABSTRACT Central pacemaker neurons regulate circadian rhythms and undergo diurnal variation in electrical activity in mammals and flies. In mammals, circadian variation in the intracellular chloride concentration of pacemaker neurons has been proposed to influence the response to GABAergic neurotransmission through GABA A receptor chloride channels. However, results have been contradictory, and a recent study demonstrated circadian variation in pacemaker neuron chloride without an effect on GABA response. Therefore, whether and how intracellular chloride regulates circadian rhythms remains controversial. Here, we demonstrate a signaling role for intracellular chloride in the Drosophila ventral lateral (LN v ) pacemaker neurons. In control flies, intracellular chloride increases in LN v neurons over the course of the morning. Chloride transport through the sodium-potassium-2-chloride (NKCC) and potassium-chloride (KCC) cotransporters is a major determinant of intracellular chloride concentrations. Drosophila melanogaster with loss-of-function mutations in the NKCC encoded by Ncc69 have abnormally low intracellular chloride six hours after lights on, and a lengthened circadian period. Loss of kcc , which is expected to increase intracellular chloride, suppresses the long-period phenotype of Ncc69 mutant flies. Activation of a chloride-inhibited kinase cascade, consisting of the WNK (With No Lysine (K)) kinase and its downstream substrate, Fray, is necessary and sufficient to prolong period length. Fray activation of an inwardly rectifying potassium channel, Irk1, is also required for the long-period phenotype. These results indicate that the NKCC-dependent rise in intracellular chloride in Drosophila LN v pacemaker neurons restrains WNK-Fray signaling and overactivation of an inwardly rectifying potassium channel to maintain normal circadian period length.