Abstract SARS-CoV-2 infection of immunocompromised individuals often leads to prolonged detection of viral RNA and infectious virus in nasal specimens, presumably due to the lack of induction of an appropriate adaptive immune response. Mutations identified in virus sequences obtained from persistently infected patients bear signatures of immune evasion and have some overlap with sequences present in variants of concern. We characterized virus isolates from two COVID-19 patients undergoing immunosuppressive cancer therapy, with all isolates obtained greater than 100 days after the initial COVID-19 diagnoses and compared to an isolate from the start of the infection. Isolates from an individual who never mounted an antibody response specific to SARS-CoV-2 despite the administration of convalescent plasma showed slight reductions in plaque size and some showed temperature-dependent replication attenuation on human nasal epithelial cell culture compared to the virus that initiated infection. An isolate from another patient - who did mount a SARS-CoV-2 IgM response – showed temperature dependent changes in plaque size as well as increased syncytia formation and escape from serum neutralizing antibody. Our results indicate that not all virus isolates from immunocompromised COVID-19 patients display clear signs of phenotypic change, but increased attention should be paid to monitoring virus evolution in this patient population.

Staphylococcus aureus can cause both acute and recurrent persistent infections such as peritonitis, endocarditis, abscess, osteomyelitis, and chronic wound infections. An effective treatment to eradicate the persistent disease is still lacking as the mechanisms of S. aureus persistence are poorly understood. In this study, we performed a comprehensive and unbiased high-throughput mutant screen using S. aureus USA300 and identified argJ, encoding an acetyltransferase in the arginine biosynthesis pathway, whose mutation produced a significant defect in persister formation in multiple drugs and stresses. Genetic complementation and arginine supplementation restored persistence in the ArgJ mutant. Quantitative real-time PCR analysis showed that the arg genes were over-expressed under drug stressed conditions and in stationary phase cultures. In addition, the ArgJ mutant had attenuated virulence in both C. elegans and mouse models of infection. Our studies identify a novel mechanism of persistence mediated by arginine metabolism in S. aureus. These findings will not only provide new insights about the mechanisms of S. aureus persistence but also offer novel therapeutic targets that may help to develop more effective treatment of persistent S. aureus infections.

Staphylococcus aureus is an opportunistic pathogen that can cause persistent infections clinically. Treatment for chronic S. aureus infections ranges from at least one week to several months and such infections are prone to relapse likely due to the presence of persistent forms of bacteria such as persister cells. Persister cells, which are bacterial cells that become dormant under stress conditions, can be isolated in vitro but their clinical significance in in vivo infections are largely unclear. Here, we evaluated S. aureus persistent forms using stationary phase cultures and biofilm bacteria (enriched in persisters) in comparison with log phase cultures in terms of their ability to cause disease in a mouse skin infection model. Surprisingly, we found that infection of mice with stationary phase cultures and biofilm bacteria produced a more severe chronic skin infection with more pronounced lesions which took longer to heal than log phase (actively growing) cultures. After two week infection, the bacterial load and skin tissue pathology, as determined by hyperplasia, immune cell infiltration, and crust/lesion formation, of mice infected with the more persistent forms (e.g. stationary phase bacteria and biofilm bacteria) were greater than mice infected with log phase bacteria. Using our persistent infection mouse model, we showed that the clinically recommended treatment for recurrent S. aureus skin infection, doxycycline + rifampin, was not effective in eradicating the bacteria in the treatment study, despite reducing lesion sizes and pathology in infected mice. Analogous findings were also observed in a Caenorhabditis elegans model, where S. aureus stationary phase cultures caused a greater mortality than log phase culture as early as two days post-infection. Thus, we established a new model for chronic persistent infections using persister bacteria that could serve as a relevant model to evaluate therapeutic options for persistent infections in general. Our findings connect persisters with persistent infections, have implications for understanding disease pathogenesis, and are likely to be broadly valid for other pathogens.

Pseudomonas aeruginosa can cause serious persistent infections such as ventilator-associated pneumonia, sepsis, biofilm-related infections as in cystic fibrosis (CF) patients. Although CF lung infections can be treated with antibiotics, full clearance is difficult due to P. aeruginosa persistence. While antibiotic activity against growing P. aeruginosa is well documented, their activity against the non-growing persisters enriched in stationary phase cultures has not been well studied. Here, we systematically evaluated and ranked the six major classes of antibiotics, cell wall and cell membrane inhibitors, protein synthesis inhibitors, DNA synthesis inhibitors, RNA synthesis inhibitors, sulfa drugs, and nitrofurantoin, for their activity against both growing and persister forms of P. aeruginosa using colony forming count (CFU) and SYBR Green I/Propidium Iodide (PI) viability assay. Among the six major classes of antibiotics, cell wall and cell membrane inhibitors (Cefuroxime and Colistin), DNA synthesis inhibitors (Clinafloxacin) and sulfa drugs (Sulfamethoxazole) had good activity against stationary phase cells. In contrast, protein synthesis inhibitors (Gentamicin), RNA synthesis inhibitor (Rifampicin) and Nitrofurantoin had relatively poor activity against the stationary phase P. aeruginosa but relatively high activity against log phase P. aeruginosa. Clinafloxacin is the only single drug that could completely kill all (109 CFU) stationary phase cells in a 4 day drug exposure. The Cefuroxime + Gentamicin+ Clinafloxacin combination could kill all biofilm bacteria in 2 days whereas the clinically used drug combination Cefuroxime + Gentamicin + Colistin only partially killed the biofilm bacteria with 103 CFU remaining. In a murine persistent CF lung infection model, only Cefuroxime + Gentamicin+ Clinafloxacin cleared all bacteria in the infected lungs, whereas Clinafloxacin alone, or Cefuroxime + Clinafloxacin, or the current recommended drug combination Cefuroxime + Gentamicin, all failed to completely clear the bacterial load in the lungs. The complete sterilization of the bacterial load is a property of Clinafloxacin combination, as Cefuroxime + Gentamicin+ Levofloxacin combination was unable to clear the bacterial load in the lungs. Our findings demonstrate the importance of persister drug clinafloxacin, offer new therapeutic approaches for more effective treatment of persistent P. aeruginosa infections, and may have implications for treating other persistent infections.

Staphylococcus aureus can cause a variety of infections, many of which involve biofilm infections. Inside biofilms, growing and non-growing bacteria such as persisters co-exist, making it challenging to completely eradicate a persistent and recurrent infection with current treatments. Despite the clinical relevance, most of the current antibiotic treatments mainly kill the growing bacteria and have poor activity against non-growing persister bacteria and thus have limited effect on treating persistent infections including biofilm infections. We previously proposed a Yin-Yang model using a drug combination approach targeting both growing bacteria and persister bacteria for more effective clearance of persistent infections. Here, as a proof of principle, we showed that combining drugs that have high activity against growing forms, such as vancomycin or meropenem, with drugs that have robust anti-persister activity, such as clinafloxacin and oritavancin, could completely eradicate S. aureus biofilm bacteria in vitro. In contrast, single or two drugs including the current treatment for persistent S. aureus infection doxycycline plus rifampin failed to kill all biofilm bacteria in vitro. We then developed a chronic persistent skin infection mouse model with biofilm-seeded bacterial inocula demonstrating that biofilm bacteria caused more severe and persistent skin lesions than log phase S. aureus bacteria. More importantly, we found that the drug combination which eradicated biofilm bacteria in vitro is more efficacious than current treatments and completely eradicated S. aureus biofilm infection in mice. The complete eradication of biofilm bacteria is attributed to the unique high anti-persister activity of clinafloxacin, which could not be replaced by other fluoroquinolones such as moxifloxacin, levofloxacin or ciprofloxacin. Our study is the first to demonstrate that the combination of meropenem, daptomycin, plus clinafloxacin completely cleared the persistent infection, healed the lesions, and had less inflammation, while mice treated with doxycycline plus rifampin, the current clinically recommended treatment for chronic tissue infection, failed to do so. We also compared our persister drug combination with other approaches for treating persistent infections including gentamicin+fructose and ADEP4+rifampin in the S. aureus biofilm infection mouse model. Neither gentamicin+fructose nor ADEP4+rifampin could eradicate or cure the persistent biofilm infection in mice. In contrast, our drug combination regimen with persister drug clinafloxacin plus meropenem and daptomycin completely eradicated and cured the persistent biofilm infection in 7 days. An unexpected observation is that ADEP4 treatment group developed worsened skin lesions and caused more extensive pathology than the untreated control mice. Our study demonstrates an important treatment principle for persistent infections by targeting both growing and non-growing heterogeneous bacterial populations utilizing persister drugs for more effective eradication of persistent and biofilm infections. Our findings may have implications for improved treatment of many other persistent infections in general.

Staphylococcus aureus is an opportunistic pathogen that causes acute and chronic infections. Due to S. aureus' s highly resistant and persistent nature, it is paramount to identify better drug targets in order to eradicate S. aureus infections. Despite the efforts in understanding bacterial cell death, the genes and pathways of S. aureus cell death remain elusive. Here, we performed a genome-wide screen using a transposon mutant library to study the genetic mechanisms involved in S. aureus cell death. Using a precisely controlled heat-ramp and acetic acid exposure assays, mutations in 27 core genes (hsdR1, hslO, nsaS, sspA, folD, mfd, vraF, kdpB, USA300HOU_2684, 0868, 0369, 0420, 1154, 0142, 0930, 2590, 0997, 2559, 0044, 2004, 1209, 0152, 2455, 0154, 2386, 0232, 0350 involved in transporters, transcription, metabolism, peptidases, kinases, transferases, SOS response, nucleic acid and protein synthesis) caused the bacteria to be more death-resistant. In addition, we identified mutations in core 10 genes (capA, gltT, mnhG1, USA300HOU_1780, 2496, 0200, 2029, 0336, 0329, 2386, involved in transporters, metabolism, transcription, cell wall synthesis) from heat-ramp and acetic acid that caused the bacteria to be more death-sensitive or with defect in persistence. Interestingly, death-resistant mutants were more virulent than the parental strain USA300 and caused increased mortality in a Caenorhabditis elegans infection model. Conversely, death-sensitive mutants were less persistent and formed less persister cells upon exposure to different classes of antibiotics. These findings provide new insights into the mechanisms of S. aureus cell death and offer new therapeutic targets for developing more effective treatments caused by S. aureus.

Lyme disease, caused by Borrelia burgdorferi, is the most common tick-borne illness in US and Europe. While most patients can be cured with a 2-4 week antibiotic therapy, about 10%-20% patients continue to suffer persistent symptoms of fatigue, pain or joint and muscle aches, and neurocognitive despite the treatment, a condition called post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS). The cause for PTLDS is unclear but one possibility is persistent infection with B. burgdorferi. B. burgdorferi is known to develop morphological variant forms such as round bodies and aggregated biofilm-like microcolonies as a log phase culture consisting of spirochete form grows into stationary phase. Here we isolated biofilm-like microcolony and planktonic form (spirochetal forms and round body) from stationary phase culture and found that the stationary phase planktonic form (SP) and microcolony form (MC) were much more tolerant to the current antibiotics for Lyme disease, doxycycline, ceftriaxone and cefuroxime than log phase spirochete form (LOG). In addition, we also compared the ability of the variant forms to cause disease in a mouse arthritis model. Surprisingly, the MC in particular and the SP caused a more severe arthritis with an earlier onset of inflammation and joint swelling than LOG. MC-infected mice showed significant joint swelling as early as 9 days post-infection, while the LOG and SP did not cause significant swelling. At 21 days, the joint swelling of the MC group dramatically increased and peaked, while the SP showed significant swelling at this time but less severe than the MC group. The LOG infected mice were just beginning to develop joint swelling at 21-day post-infection, with only slight swelling. At 30-day post infection, the SP group mice also developed similar severity of joint swelling as the MC group, but the LOG group still did not show significant swelling. However, at 35-day post infection, all three infected groups showed similar degree of significant joint swelling. Thereafter, the joint swelling of the three infected groups waxed and waned during the 90-day observation. Thus, we established a new biofilm-inocula mediated visual arthritis model that could facilitate more efficient evaluation of treatment regimens for persistent B. burgdorferi infections. Our findings provide new insight about disease pathogenesis and may have implications for understanding PTLDS and PTLDS treatment failure, due to possible biofilm inoculation during tick-bite. This biofilm/persister seeding model may be valid for different microbial infections and facilitate developing more effective treatments of persistent infections in general.

Purpose: Antimicrobial resistance (AMR) is a public health threat where efficient surveillance is needed to prevent outbreaks. Existing methods for detection of gastrointestinal colonization of multidrug-resistant organisms (MDRO) are limited to specific organisms or resistance mechanisms. Metagenomic next-generation sequencing (mNGS) is a rapid and agnostic diagnostic approach for microbiome and resistome investigations. We determined if mNGS can detect MDRO from rectal swabs in concordance with standard microbiology results. Methods: We performed and compared mNGS performance on short-read Illumina MiSeq (N=10) and long-read Nanopore MinION (N=4) platforms directly from peri-rectal swabs to detect vancomycin-resistant enterococci (VRE) and carbapenem-resistant Gram-negative organisms (CRO). Results: We detected E. faecium (N=8) and E. faecalis (N=2) with associated van genes (9/10) in concordance with VRE culture-based results. We studied the microbiome and identified CRO organisms, P. aeruginosa (N=1), E. cloacae (N=1), and KPC-producing K. pneumoniae (N=1). Nanopore real-time detection detected the blaKPC gene in 2.5 minutes and provided genetic context (blaKPC harbored on pKPC_Kp46 IncF plasmid). Illumina sequencing provided accurate allelic variant determination (i.e., blaKPC-2) and strain typing of the K. pneumoniae (ST-15). Conclusions: We demonstrated an agnostic approach for surveillance of MDRO, examining advantages of both short and long-read mNGS methods for AMR detection.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.