Abstract Host bottlenecks prevent many infections before the onset of disease by eliminating invading pathogens. Monitoring the diversity of a barcoded population of the diarrhea causing bacterium Citrobacter rodentium during colonization of its natural host, mice, allowed us to determine the number of cells that found the infection by establishing a replicative niche. The size of the pathogen’s founding population scaled with dose and was controlled by a severe yet slow-acting bottleneck. Reducing stomach acid or changing host genotype modestly relaxed the bottleneck without breaking the fractional relationship between dose and founders. In contrast, disrupting the microbiota caused the founding population to no longer scale with the size of the inoculum and allowed the pathogen to infect at almost any dose, indicating that the microbiota creates the dominant bottleneck. Further, in the absence of competition with the microbiota, the diversity of the pathogen population slowly contracted as the population was overtaken by bacteria that lost the critical virulence island, the locus of enterocyte effacement (LEE). Collectively, our findings reveal that the mechanisms of protection by colonization bottlenecks are reflected in and can be generally defined by the impact of dose on the pathogen’s founding population.

Transposon insertion sequencing (Tn-seq) is a powerful method for genome-scale functional genetics in bacteria. However, its effectiveness is often limited by a lack of mutant diversity, caused by either inefficient transposon delivery or stochastic loss of mutants due to population bottlenecks. Here, we introduce "InducTn-seq", which leverages inducible mutagenesis for temporal control of transposition. InducTn-seq generates millions of transposon mutants from a single colony, enabling the sensitive detection of subtle fitness defects and transforming binary classifications of gene essentiality into a quantitative fitness measurement across both essential and non-essential genes. Using a mouse model of infectious colitis, we show that InducTn-seq bypasses a highly restrictive host bottleneck to generate a diverse transposon mutant population from the few cells that initiate infection, revealing the role of oxygen-related metabolic plasticity in pathogenesis. Overall, InducTn-seq overcomes the limitations of traditional Tn-seq, unlocking new possibilities for genome-scale forward genetic screens in bacteria.

Abstract Shiga toxin-producing E. coli (STEC) can give rise to a range of clinical outcomes from diarrhea to the life-threatening systemic condition, hemolytic uremic syndrome (HUS). Although STEC O157:H7 is the serotype most frequently associated with HUS, a major outbreak of HUS occurred in 2011 in Germany, and was caused by a rare serotype, STEC O104:H4. Prior to 2011 and since the outbreak, STEC O104:H4 strains have only rarely been associated with human infections. From 2012 to 2020 intensified STEC surveillance was performed in Germany where subtyping of ∼8,000 clinical isolates by molecular methods including whole genome sequencing was carried out. A rare STEC serotype O181:H4 associated with HUS was identified and, like the STEC O104:H4 outbreak strain, this strain belongs to sequence type (ST) 678. Genomic and virulence comparisons revealed that the two strains are phylogenetically related and differ principally in the gene cluster encoding their respective lipopolysaccharide O-antigens but exhibit similar virulence phenotypes. In addition, five other serotypes belonging to ST678 from human clinical infection, such as OX13:H4, O127:H4, OgN-RKI9:H4, O131:H4, and O69:H4, were identified from diverse locations worldwide. Importance Our data suggest the high virulence ensemble of the STEC O104:H4 outbreak strain remains a global threat because genomically similar strains cause disease worldwide, but that horizontal acquisition of O-antigen gene clusters has diversified the O-antigens of strains belonging to ST678. Thus, identification of these highly pathogenic strains is masked by diverse and rare O-antigens, thereby confounding the interpretation of their potential risk.