Research Article1 October 1990free access Protein–DNA contacts in the structure of a homeodomain–DNA complex determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy in solution. G. Otting G. Otting Institut für Molekularbiologie und Biophysik. ETH-Hönggerberg, Zürich, Switzerland. Search for more papers by this author Y. Q. Qian Y. Q. Qian Institut für Molekularbiologie und Biophysik. ETH-Hönggerberg, Zürich, Switzerland. Search for more papers by this author M. Billeter M. Billeter Institut für Molekularbiologie und Biophysik. ETH-Hönggerberg, Zürich, Switzerland. Search for more papers by this author M. Müller M. Müller Institut für Molekularbiologie und Biophysik. ETH-Hönggerberg, Zürich, Switzerland. Search for more papers by this author M. Affolter M. Affolter Institut für Molekularbiologie und Biophysik. ETH-Hönggerberg, Zürich, Switzerland. Search for more papers by this author W. J. Gehring W. J. Gehring Institut für Molekularbiologie und Biophysik. ETH-Hönggerberg, Zürich, Switzerland. Search for more papers by this author K. Wüthrich K. Wüthrich Institut für Molekularbiologie und Biophysik. ETH-Hönggerberg, Zürich, Switzerland. Search for more papers by this author G. Otting G. Otting Institut für Molekularbiologie und Biophysik. ETH-Hönggerberg, Zürich, Switzerland. Search for more papers by this author Y. Q. Qian Y. Q. Qian Institut für Molekularbiologie und Biophysik. ETH-Hönggerberg, Zürich, Switzerland. Search for more papers by this author M. Billeter M. Billeter Institut für Molekularbiologie und Biophysik. ETH-Hönggerberg, Zürich, Switzerland. Search for more papers by this author M. Müller M. Müller Institut für Molekularbiologie und Biophysik. ETH-Hönggerberg, Zürich, Switzerland. Search for more papers by this author M. Affolter M. Affolter Institut für Molekularbiologie und Biophysik. ETH-Hönggerberg, Zürich, Switzerland. Search for more papers by this author W. J. Gehring W. J. Gehring Institut für Molekularbiologie und Biophysik. ETH-Hönggerberg, Zürich, Switzerland. Search for more papers by this author K. Wüthrich K. Wüthrich Institut für Molekularbiologie und Biophysik. ETH-Hönggerberg, Zürich, Switzerland. Search for more papers by this author Author Information G. Otting1, Y. Q. Qian1, M. Billeter1, M. Müller1, M. Affolter1, W. J. Gehring1 and K. Wüthrich1 1Institut für Molekularbiologie und Biophysik. ETH-Hönggerberg, Zürich, Switzerland. The EMBO Journal (1990)9:3085-3092https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1990.tb07505.x PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The 1:1 complex of the mutant Antp(C39––S) homeodomain with a 14 bp DNA fragment corresponding to the BS2 binding site was studied by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy in aqueous solution. The complex has a molecular weight of 17,800 and its lifetime is long compared with the NMR chemical shift time scale. Investigations of the three-dimensional structure were based on the use of the fully 15N-labelled protein, two-dimensional homonuclear proton NOESY with 15N(omega 2) half-filter, and heteronuclear three-dimensional NMR experiments. Based on nearly complete sequence-specific resonance assignments, both the protein and the DNA were found to have similar conformations in the free form and in the complex. A sufficient number of intermolecular 1H-1H Overhauser effects (NOE) could be identified to enable a unique docking of the protein on the DNA, which was achieved with the use of an ellipsoid algorithm. In the complex there are intermolecular NOEs between the elongated second helix in the helix-turn-helix motif of the homeodomain and the major groove of the DNA. Additional NOE contacts with the DNA involve the polypeptide loop immediately preceding the helix-turn-helix segment, and Arg5. This latter contact is of special interest, both because Arg5 reaches into the minor groove and because in the free Antp(C39––S) homeodomain no defined spatial structure could be found for the apparently flexible N-terminal segment comprising residues 0-6. Previous ArticleNext Article Volume 9Issue 101 October 1990In this issue RelatedDetailsLoading ...

Abstract Combinatorial signaling is key to instruct context-dependent cell behaviors. During embryonic development, adult homeostasis and disease, Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) act as dimers to instruct specific cellular responses. BMP ligands can form both homo- or heterodimers; however, obtaining direct evidence of the endogenous localization and function of each form has proven challenging. Here, we make use of precise genome editing and direct protein manipulation via protein binders to dissect the existence and functional relevance of BMP homo- and heterodimers in the Drosophila wing imaginal disc. This approach revealed in situ the existence of Dpp (BMP2/4)/Gbb (BMP5/6/7/8) heterodimers. We found that Gbb, despite being produced by all the cells of the wing imaginal disc, is only secreted by the cells in which Dpp is expressed. Dpp and Gbb form a gradient of heterodimers whereas neither Dpp nor Gbb homodimers are evident under endogenous physiological conditions. We find that the formation of heterodimers is critical for obtaining optimal signaling and long-range BMP distribution in the developing wing. These results indicate that Dpp/Gbb heterodimers are the active signal required for epithelial patterning and growth.

Summary How morphogen gradients control patterning and growth in developing tissues remains largely unknown due to lack of tools manipulating morphogen gradients. Here, we generate two membrane-tethered protein binders that manipulate different aspects of Decapentaplegic (Dpp), a morphogen required for overall patterning and growth of the Drosophila wing. “HA trap” is based on a single-chain variable fragment (scFv) against the HA tag that traps HA-Dpp to mainly block its dispersal, while “Dpp trap” is based on a Designed Ankyrin Repeat Protein (DARPin) against Dpp that traps Dpp to block both its dispersal and signaling. Using these tools, we found that, while posterior patterning and growth require Dpp dispersal, anterior patterning and growth largely proceed without Dpp dispersal. We show that dpp transcriptional refinement from an initially uniform to a localized expression and persistent signaling in transient dpp source cells render the anterior compartment robust against the absence of Dpp dispersal. Furthermore, despite a critical requirement of dpp for the overall wing growth, neither Dpp dispersal nor direct signaling is critical for lateral wing growth after wing pouch specification. These results challenge the long-standing dogma that Dpp dispersal is strictly required to control and coordinate overall wing patterning and growth.

Abstract Reversible protein phosphorylation by kinases in extensively used to control a plethora of processes essential for proper development and homeostasis of multicellular organisms. One main obstacle in studying the role of a defined kinase-substrate interaction is that kinases form complex signaling networks and most often phosphorylate multiple substrates involved in various cellular processes. In recent years, several new approaches have been developed to control the activity of a given kinase. However, most of them fail to regulate a single protein target, likely hiding the effect of a unique kinase-substrate by pleiotropic effects. To overcome this limitation, we have created protein binder-based engineered kinases for direct, robust and tissue-specific phosphorylation of target fluorescent protein fusions in vivo . We show that synthetic Rok kinases, based on the Drosophila ortholog of Rho-associated protein kinase (ROCK), are functional enzymes and can activate myosin II through phosphorylation of Sqh::GFP or Sqh::mCherry in different morphogenetic processes in a developing fly embryo. We next use the system to study the impact of actomyosin activation specifically in the developing tracheal branches and showed that ectopic activation of actomyosin with engineered Rok kinase did not prevent cell intercalation nor the formation of autocellular junctions. We assume that this approach can be adapted to other kinases and targets in various eukaryotic genetic systems.

Abstract Blood vessel morphogenesis is driven by coordinated endothelial cell behaviors, which depend on dynamic cell-cell interactions. Remodeling of endothelial cell-cell junctions promote morphogenetic cellular events while preserving vascular integrity. Here, we have analyzed the dynamics of endothelial cell-cell junctions during lumen formation in angiogenic sprouts. By live-imaging of the formation of intersegmental blood vessels in zebrafish, we demonstrate that lumen expansion is accompanied by the formation of transient finger-shaped junctions. Formation and maintenance of these junctional fingers are positively regulated by blood pressure whereas inhibition of blood flow prevents their formation. Using fluorescent reporters, we show that the tension-sensor Vinculin localizes to junctional fingers. Furthermore, loss of vinculin function, in vinculin a and - b double knockouts, prevents junctional finger formation in angiogenic sprouts, whereas endothelial expression of a vinculin transgene is sufficient to restore junctional fingers. Taken together, our findings suggest a mechanism in which lumen expansion during angiogenesis leads to an increase in junctional tension, which triggers recruitment of vinculin and formation of junctional fingers. We propose that endothelial cells may employ force-dependent junctional remodeling to react to changes in external forces to protect cell-cell contacts and to maintain vascular integrity during sprouting angiogenesis.